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Le istone-deacetilasi (HDACs) costituiscono una famiglia di enzimi che catalizzano l'idrolisi del gruppo acetile dai residui di lisina sulle code N-terminali degli istoni. Agendo direttamente sulle proteine istoniche le HDAC possono modulare l’accessibilità al DNA e quindi regolare la trascrizione genica, nonché controllare il ciclo cellulare, regolando l’accessibilità ai geni coinvolti nella proliferazione, differenziazione e apoptosi cellulare. Oltre al loro ruolo primario in questo meccanismo di azione, è stato evidenziato che, le HDAC sono in grado di interagire anche con proteine non istoniche coinvolte in diversi pathway biologici come quelli implicati nella modulazione dell'espressione degli enzimi di riparazione del DNA, dei fattori di trascrizione e dei regolatori nucleari.
L'attività delle istone deacetilasi si esplica attraverso un'azione diretta, conseguente alla deacetilazione delle proteine bersaglio, oppure in modo indiretto, mediante la modulazione della struttura della cromatina. Ad oggi si conoscono 18 isoforme di HDACs le quali sono classificate in quattro classi in base alla struttura e omologia con le HDAC di Saccharomyces cerevisiae, alla localizzazione cellulare e alla loro attività catalitica. Le HDAC di classe I,II e IV sono metallo enzimi zinco dipendenti, mentre quelle di classe III sono NAD+ dipendenti. Di particolare interesse, appartenente alla classe II, risulta l’isoforma HDAC6, in quanto rappresenta un ottimo target terapeutico per le malattie neurodegenerative, disturbi immunologici e cancro. Questa isoforma ha una localizzazione prevalentemente citoplasmatica e agisce su substrati proteici non istonici. HDAC6, presenta una struttura complessa caratterizzata da due domini catalitici, noti come CD1 e CD2. La funzione biologica del dominio CD2 è principalmente associata alla deacetilasi della tubulina e dell'istone. Tuttavia, le precise funzioni biologiche del dominio CD1 di HDAC6 sono ancora soggette a ulteriori indagini e chiarimenti. Sono stati condotti diversi studi che hanno evidenziato alcune differenze strutturali nel sito attivo del dominio CD2 di HDAC6 rispetto ad altri isoenzimi HDAC. Queste variazioni strutturali sono fondamentali per la progettazione e lo sviluppo di inibitori selettivi mirati a HDAC6, offrendo così opportunità significative per la ricerca farmacologica e terapeutica.
Le HDACs sono coinvolte sia nella tumorigenesi che nelle malattie neurodegenerative, influenzando processi chiave legati alla regolazione genica e alla fisiologia cellulare.
La perdita di agenti acetilanti in combinazione con l’aumento dell’attività dell’HDAC risulta essere una delle anomalie epigenetiche più diffuse nei tumori. Inoltre, è stato dimostrato che questi enzimi nelle prime fasi della progressione tumorale, bloccano i geni deputati al controllo della crescita cellulare e questo porta a una proliferazione incontrollata, perdita di differenziazione nonché inibizione dell’apoptosi. Nelle fasi più avanzate invece, l’enzima HDAC è responsabile del silenziamento dei geni deputati al controllo dell’adesione, migrazione e invasione cellulare. Infine, la comunità scientifica ha evidenziato il coinvolgimento delle HDACs nell’angiogenesi indotta dall’ipossia e la loro capacità di regolare le metastasi influenzando la composizione della matrice extracellulare e l’espressione di proteine coinvolte in questi processi. Recentemente è stato segnalato anche il coinvolgimento dell’HDAC nelle malattie neurodegenerative, dal momento che esiste una correlazione tra HDAC6 e la formazione di agglomerati proteici anomali come la proteina Tau e Aβ. Inducendo il blocco della formazione e proliferazione di tali proteine, tramite il meccanismo Glycogen synthase kinase-3 (GSK3β) dipendente è possibile utilizzare inibitori specifici HDAC6 per il trattamento di patologie neurodegenerative. Ad oggi, tra le tante molecole progettate come inibitori di HDAC, solo quattro sono state approvate dall’FDA: Romidepsin, Vorinostat (SAHA), Belinostat e Panobinostat.Sono farmaci utilizzati per il trattamento del linfoma a cellule T e mieloma multiplo. L’esiguo numero di farmaci approvati è dovuto alla mancanza di selettività di queste molecole che comporta una serie di importanti effetti collaterali, tra cui cardiotossicità, trombocitopenia e anoressia. Recentemente, come alternativa ai pan inibitori la ricerca si è concentrata verso la sintesi di farmaci selettivi per HDAC6, sfruttando le differenze strutturali del dominio catalitico CD2. Questi inibitori sono costituiti da diversi elementi funzionali cruciali. Innanzitutto, è presente un "gruppo legante lo zinco" (ZBG), che si coordina all'ione zinco nel sito attivo dell'enzima. Successivamente, è presente un linker molecolare, che può essere flessibile o rigido, e che collega il gruppo legante lo zinco all’altra porzione dell'inibitore, denominata "capping group", il quale è in grado di creare interazioni specifiche nella fessura del sito attivo esterno di HDAC6.Il sistema endocannabinoide (ECS) è un sistema di segnalazione ubiquitario, implicato in varie funzioni fisiologiche e metaboliche dell’organismo quali nocicezione, appetito, regolazione metabolica, neurotrasmissione e neurogenesi, risposta infiammatoria e immunitaria, metabolismo osseo e controllo motorio. Tale sistema è costituito principalmente da due sottotipi recettoriali, noti come CB1R e CB2R, dai relativi endocannabinoidi (ECs) come l'anandamide (AEA) e il 2-arachidonilglicerolo (2-AG), insieme agli enzimi coinvolti nella loro sintesi e metabolismo. I CB1R e CB2R sono recettori metabotropici appartenenti alla famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) di classe A (classe della rodopsina) e differiscono per la sequenza amminoacidica, la distribuzione tissutale, il meccanismo di trasduzione del segnale e la sensibilità ai ligandi dell’organismo.
Il CB1R, principalmente distribuito nel sistema nervoso centrale (SNC) in aree quali i gangli della base, l'amigdala, l'ippocampo, la corteccia e il cervelletto, mostra effetti antiemetici, antiossidanti, antiinfiammatori, analgesici e antispastici. Contrariamente, il CB2R, inizialmente individuato a livello periferico, soprattutto in regioni coinvolte nella regolazione immunitaria come milza, tonsille, macrofagi, cellule B e T, è coinvolto nella migrazione cellulare e nel controllo del rilascio di citochine. Successivamente ulteriori ricerche hanno rivelato la presenza di CB2R anche in alcune aree del SNC, come la microglia e gli astrociti, dove contribuisce in modo significativo alla progressione dell'infiammazione e alla degenerazione neuronale.
I CBRs vengono attivati dagli endocannabinoidi, lipidi endogeni bioattivi derivanti dall’acido arachidonico, di cui i principali esponenti sono AEA e 2-AG. AEA, agisce da agonista parziale nei confronti di entrambi i recettori, manifestando una maggiore affinità per il CB1R, mentre 2-AG, agisce come agonista puro su entrambi i CBRs, presentando un’affinità simile. Il CB2R emerge come un obiettivo terapeutico più promettente rispetto al CB1R, grazie alla mancanza di effetti collaterali centrali, ai suoi livelli di espressione più bassi nel SNC e alla sua inducibilità, poiché la sua espressione aumenta rapidamente nel cervello in seguito a condizioni patologiche. Gli effetti neuroprotettivi esercitati dall'attivazione del CB2R sono stati osservati nelle malattie di Alzheimer, Parkinson, Huntington e nella sclerosi laterale amiotrofica. In questo contesto, molti ligandi selettivi per il CB2R sono stati sintetizzati e sviluppati negli anni e sono risultati capaci di esercitare un effetto neuroprotettivo che coinvolge le cellule della microglia o la modulazione dell'eccitabilità neuronale. In campo oncologico, invece è stata riscontrata un'elevata espressione di CB2R in diversi tipi di cancro, come quello alla mammella, al polmone, alla prostata, al pancreas e in tumori resistenti; tutte queste evidenze rendono i modulatori del CB2R dei potenziali agenti terapeutici per il trattamento di diverse condizioni patologiche in cui è coinvolta l'infiammazione, come il cancro e la neurodegenerazione.
Tuttavia, il carattere multifattoriale di questi stati patologici rende difficile l'applicazione del classico "one target-one disease" e una strategia promettente è rappresentata dai ligandi multi-target (MTDLs). Tale approccio terapeutico è già stato applicato per la progettazione di inibitori multi-target basati su HDAC, che combinano l'inibizione dell'HDAC con l'azione su altri bersagli molecolari come janus chinasi (JAK), fosfodiesterasi 5 (PDE5) e fosfatidilinositolo-3 chinasi (PI3K). Nell’ambito della ricerca sui cannabinoidi invece, sono stati riportati in letteratura approcci multi-target per il trattamento della malattia di Alzheimer che combinano l'attivazione del CB2R con l'acetilcolinesterasi (AChE) e la butirrilcolinesterasi (BChE).
Questa strategia farmacologica mira a colpire più di un bersaglio biologico simultaneamente, al fine di ottenere effetti terapeutici più efficaci e duraturi. In altre parole, con una singola molecola si riesce ad avere un’azione simultanea su target differenti coinvolti nella stessa patologia, una maggior compliance, minor effetti collaterali tipici di una terapia single-target e composti più potenti e attivi. Questa strategia rappresenta quindi la possibilità più promettente per il trattamento di patologie complesse come il cancro, patologie neurodegenerative, disturbi cardiaci e autoimmuni.
Prendendo in considerazione gli aspetti sopra riportati in merito al cross-talk tra il CB2R e l’enzima HDAC e alla sua rilevanza nel trattamento di patologie neurodegenerative, lo scopo della mia tesi è stato quello sintetizzare nuovi potenziali ligandi duali CB2R/HDAC6. L'approccio di "drug design" perseguito si basa su una combinazione dei gruppi farmacoforici dei ligandi selettivi CB2R e di inibitori HDAC6. A tale scopo, come farmacoforo del CB2R è stato selezionato il gruppo dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossammidici, ampiamente documentati in letteratura come potenti agonisti osterici e selettivi per il CB2R, nonché dotati di proprietà immunomodulatrici e antiinfiammatorie. Queste proprietà sono state confermate attraverso studi in vitro condotti su linfociti attivi isolati da pazienti affetti da sclerosi multipla. Per quanto riguarda la porzione deputata all’interazione con il sito catalitico del HDAC6 invece, è stato individuato come farmacoforo il gruppo funzionale idrossammico (CONHOH), che è risultato il più promettente tra tutti candidati ZBG proposti in letteratura.
Il disegno razionale, le strategie sintetiche adoperate, nonché la caratterizzazione dei composti finali e degli intermedi di sintesi saranno discussi nell’elaborato finale di questa tesi di laurea.