• convalida
• frammento Fc
• immunoglobuline

Il presente lavoro di tesi tratta della messa a punto e della convalida di un metodo analitico per la “Determinazione della Funzione Fc in campioni di Immunoglobuline” per l’analisi dei prodotti finiti Immunoglobuline IgG 5% ed IgG 10% per somministrazione endovenosa. Tale lavoro è stato svolto nel Laboratorio Controllo Qualità Biochimica a Bolognana (LU) dell’azienda Kedrion Biopharma S.p.A.
Le immunoglobuline umane (IgG) vengono prodotte attraverso un processo di frazionamento delle componenti plasmatiche a partire da plasma umano; in questo modo, a partire dal donatore arrivano al paziente come prodotto finito. Esse vengono utilizzate per la cura di diverse patologie correlabili principalmente ad immunodeficienze, ovvero situazioni in cui il soggetto è carente di componenti del sistema immunitario. Ciò rende il soggetto maggiormente esposto ad infezioni e ad alcune patologie tumorali, risultando così in pericolo anche in situazioni che un corpo sano supererebbe senza difficoltà. L’immunodeficienza può essere primitiva, ossia presente fin dalla nascita e generalmente genetica, o acquisita, causata cioè da diversi fattori quali malattie (come ad esempio AIDS derivante dall’infezione dal virus dell’HIV), invecchiamento, farmaci, malnutrizione, chemioterapia, radioterapia e stress.
La “Determinazione della Funzione Fc in campioni di immunoglobuline” è un test riportato nella Farmacopea Europea (monografia 2.7.9.) e permette di andare a verificare che la regione Fc delle IgG sia ancora integra dopo aver subito le diverse fasi del processo produttivo.
Una IgG è costituita da quattro catene polipeptidiche comprendenti due catene pesanti (H) identiche tra loro e due leggere (L) anch’esse identiche tra loro; ciascuna catena inoltre contiene una regione variabile ed una costante. Le quattro catene sono assemblate formando una struttura ad Y. Ogni molecola anticorpale può essere funzionalmente suddivisa in tre porzioni: due regioni Fab e una regione Fc. Le regioni Fab (Fragment antigen binding) riconoscono l’antigene legandosi ad esso, mentre la regione Fc (detta “Frammento cristallizzabile”) è responsabile della maggior parte delle attività biologiche e delle funzioni effettrici degli anticorpi. Tra le attività della regione Fc troviamo il legame con alcuni fattori della via classica del complemento (elemento essenziale nella difesa umorale del sistema immunitario): quest’ultimo utilizza il legame con l’anticorpo per ancorarsi alla superficie della particella estranea e mettere in atto la cascata di reazioni che porta alla sua eliminazione. Nel metodo analitico oggetto di tesi si va quindi a valutare se la regione Fc dell’IgG, alla fine del processo di produzione, è ancora in grado di svolgere la sua azione, che è di fondamentale importanza per l’efficacia del farmaco.
Il test simula ciò che avviene in vivo ed è composto da più fasi:
1. Preparazione dei reagenti;
2. Preparazione dei globuli rossi umani tannati;
3. Coniugazione dell’antigene ai globuli rossi umani tannati;
4. Legame dell’anticorpo ai globuli rossi tannati sensibilizzati con l’antigene;
5. Emolisi complemento mediata;
6. Valutazione dei risultati.

Le IgG, essendo prodotte attraverso un processo di frazionamento di un pool di plasma ottenuto da differenti donatori, contengono tutti gli anticorpi presenti nella popolazione dei donatori. Poiché gli anticorpi della rosolia sono molto comuni, tutte le IgG prodotte in questo modo contengono tali anticorpi. Per la determinazione della loro integrità, le IgG sono incubate assieme ai globuli rossi sensibilizzati con l’antigene della rosolia, con cui formano immunocomplessi. Tale miscela viene quindi messa a reagire con il complemento, e gli immunocomplessi attivano il sistema del complemento per mezzo del frammento Fc. La lisi dei globuli rossi è così determinata dall’attivazione della catena proteica del complemento. L’emolisi causata dal frammento Fc risulta minore o assente nei preparati di IgG con il frammento Fc danneggiato. I risultati ottenuti vengono valutati utilizzando un preparato standard di riferimento, l’IgG umana BRP, standard della Farmacopea Europea. La percentuale di emolisi e quindi la percentuale di frammento Fc presente nell’ IgG da analizzare rispetto allo standard viene determinata andando a misurare, attraverso uno spettrofotometro a micropiastra, l’assorbanza a 541 nm dei pozzetti contenenti l’immunocomplesso e il complemento aggiunto. Si ottiene in questo modo una curva cinetica dove in ordinata si ha l’assorbanza e in ascissa il tempo: la curva avrà un andamento decrescente fino a raggiungere, dopo un determinato intervallo di tempo, un’assorbanza costante, indice della terminazione dell’emolisi dei globuli rossi.
Il punto di flesso della curva rappresenta l’emolisi massima; quindi, attraverso successivi calcoli viene ricavato “l’indice di frammento Fc” (IFC) contenuto nell’IgG in analisi, rispetto all’ IgG standard BRP.
Il valore di IFC per risultare accettabile non deve essere inferiore a quello riportato sul certificato che accompagna la soluzione di riferimento, ovvero IFC > 60%.

La convalida di un metodo analitico consiste nello sviluppo e nella verifica dell’efficienza del metodo stesso in relazione alle specifiche del prodotto da analizzare. È quindi uno studio mediante il quale si stabilisce, attraverso prove di laboratorio, se un metodo d’analisi è efficiente ed in grado di poter soddisfare i requisiti previsti per le applicazioni specifiche del metodo stesso.
Il metodo analitico oggetto della presente tesi appartiene ai Metodi Ufficiali (Comphendial Method), ovvero fa parte del gruppo di procedure analitiche descritte nella Farmacopea Europea, pertanto risultano accettate degli enti regolatori. Esso è considerato un test biologico applicabile come descritto in Farmacopea Europea e per questo motivo è da convalidare con strategie che ne assicurino la trasferibilità: in questo caso sono sufficienti le prove di precisione (intermedia ed entro la serie) e la verifica della robustezza.
La precisione in un test esprime il grado di dispersione tra una serie di misure ottenute da una campionatura multipla dello stesso campione omogeneo sotto condizioni prescritte. Essa fornisce un’indicazione di errori casuali.
La determinazione della precisione intermedia ha l’obiettivo di valutare il grado di precisione dei risultati analitici ottenuti in condizioni operative diverse all’interno dello stesso laboratorio di analisi. Nel disegno sperimentale come variabili sono stati scelti giorni diversi, differenti operatori e differenti preparazioni di reagenti per diversificare le condizioni di analisi quanto più possibile.
La determinazione della precisione entro la serie ha l’obiettivo di valutare la ripetibilità del metodo, ovvero il grado di precisione dei risultati analitici, quando la procedura analitica in esame è applicata ripetutamente su uno stesso campione omogeneo.
Determinare la robustezza del metodo significa verificare che il metodo analitico non sia influenzato da piccole variazioni di alcuni dei suoi parametri operativi.