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Tesi etd-06202007-123154


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Tedone, Rosalia
URN
etd-06202007-123154
Title
"Ruolo dell'istamina nella generazione di microparticelle di origine monocitaria e sintesi di IL-8 e MCP-1 da parte di cellule epiteliali delle vie aeree"
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
Relatore Celi, Alessandro
Parole chiave
  • vie aeree
  • infiammazione
  • MCP-1
  • IL-8
  • chemochine
  • istamina
Data inizio appello
16/07/2007;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
16/07/2047
Riassunto analitico
Riassunto<br>Le microparticelle (MP) sono state descritte per la prima volta nel 1967<br>come frammenti di membrana cellulare presenti nel plasma umano.<br>Originariamente considerati artefatti in vitro o detriti cellulari privi di<br>significato fisiologico, in questi ultimi anni sono aumentate le evidenze<br>documentate di un ruolo delle MP stesse come modulatori di differenti<br>processi fisiopatologici come la coagulazione, le funzioni vascolari e<br>l¡¯infiammazione. In vitro, il rilascio delle MP pu¨° avvenire a partire da<br>diversi tipi cellulari stimolati o apoptotici (cellule endoteliali, piastrine,<br>leucociti, eritrociti) e l¡¯origine cellulare e la composizione delle MP<br>cambia come popolazione nelle varie condizioni patologiche. Le MP si<br>possono formare durante l¡¯attivazione cellulare attraverso diversi<br>meccanismi, ma in generale il rilascio di MP ¨¨ tempo e Ca2+ dipendente.<br>In vitro, l¡¯attivazione cellulare si pu¨° osservare in seguito a stimolazione<br>con diversi agonisti come trombina, calcio ionoforo, LPS, che<br>determinano aumento di Ca2+ citosolico, specialmente nel sito di<br>vescicolazione.<br>In un lavoro precedente svolto nel nostro laboratorio era stato dimostrato<br>che i monociti/macrofagi umani stimolati con il calcio ionoforo A23187<br>liberano MP con potenzialit¨¤ proinfiammatoria nei confronti dell¡¯epitelio<br>delle vie aeree. Lo scopo del mio progetto ¨¨ quello di verificare<br>l¡¯esistenza di stimoli fisiologicamente rilevanti in grado di produrre MP.<br>Tra i potenziali stimoli fisiologici si ¨¨ pensato all¡¯istamina. L¡¯istamina ¨¨<br>un¡¯ammina primaria accumulata in granuli di secrezione dei basofili e dei<br>mastociti ed ¨¨ implicata come mediatore nelle reazioni allergiche. In<br>particolare, tramite l¡¯attivazione dei recettori H1, esercita una gran variet¨¤<br>di effetti ed ¨¨ implicata in situazioni patologiche quali l¡¯asma bronchiale e<br>la rinite allergica, essa influenza inoltre la risposta del sistema<br>immunitario modulando l¡¯attivit¨¤ dei linfociti T, dei monociti e dei<br>macrofagi. Questo studio si prefissa quindi di esaminare il ruolo di basse<br>concentrazioni fisiologicamente rilevanti di istamina sull¡¯attivazione di<br>monociti/macrofagi e valutarne gli effetti sulla produzione di chemochine<br>proinfiammatorie quali IL-8 e MCP-1 da parte di cellule dell¡¯epitelio<br>delle vie aeree. A tale proposito sono stati fatti esperimenti in parallelo, in<br>cui lo stesso materiale, utilizzato per le analisi citofluorimetriche, ¨¨ stato<br>incubato con cellule di una linea cellulare, A549 (cellule neoplastiche in<br>coltura continua originariamente ottenute da un paziente affetto da<br>carcinoma bronchiolo-alveolare, che mantengono un fenotipo alveolare e<br>sono utilizzate come modello di epitelio delle vie aeree). I monociti sono<br>stati isolati da sangue periferico di donatori normali in seguito a<br>centrifugazione per gradiente con Ficoll/Histopaque e fatti aderire su<br>plastica per 18h. Il rilascio di MP da monociti aderenti ¨¨ stato stimolato<br>con istamina (30¦ÌM) per tempi diversi e il surnatante ¨¨ stato raccolto ed<br>utilizzato come stimolo sulle A549. Dopo 18h d¡¯incubazione, il mezzo<br>condizionato ¨¨ analizzato per il rilascio di IL-8 e MCP-1 con kit ELISA<br>disponibile commercialmente. Da esperimenti preliminari si osserva che<br>la concentrazione (pg/mL) nel mezzo condizionato delle A549 ¨¨ di 117,5<br>per le cellule non stimolate; 1524 e 2047 per le cellule incubate con il<br>surnatante di monociti non stimolati e stimolati con istamina (30¦ÌM) per<br>2h, rispettivamente. La filtrazione del surnatante di monociti stimolati con<br>istamina con un filtro da 0,22¦Ìm riduce la concentrazione a 1582,<br>dimostrando che l¡¯effetto ¨¨ in parte mediato da particelle corpuscolare e<br>non da molecole solubili; l¡¯azione diretta di istamina sulle A549 porta ad<br>un rilascio di IL-8 pari a 247,5 indicando che gli effetti non sono dovuti<br>appunto ad attivit¨¤ diretta dell¡¯istamina (dati di un esperimento<br>rappresentativo). Per quanto riguarda la sintesi di MCP-1, si hanno i<br>seguenti risultati (risultati espressi in pg/mL): Basale=421; Surnatante<br>non stimolato=630; Surnatante stimolato per 15¡¯ (MP)=811,5; Surnatante<br>stimolato ultrafiltrato(100kd cut off)=217,5; A549+ istamina=418(dati di<br>un esperimento rappresentativo). L¡¯attivazione cellulare mediata dal<br>recettore H1 ¨¨ confermata dal fatto che il rilascio di IL-8 e MCP-1 indotto<br>da istamina ¨¨ inibito in maniera concentrazione-dipendente da un agonista<br>selettivo per il recettore H1, la prometazina. I risultati ottenuti mediante<br>tecnica ELISA verranno affiancate a indagini molecolari allo scopo di<br>confermare che le variazioni di concentrazioni delle chemochine<br>riflettano le variazioni a livello trascrizionale. Da questo studio<br>preliminare, si pu¨° concludere che l¡¯istamina svolge, tra le altre,<br>un¡¯attivit¨¤ proinfiammatoria inducendo il rilascio di MP da parte dei<br>monociti. Queste rappresentano un meccanismo per amplificare la<br>concentrazione locale delle citochine infiammatorie e chemiotattiche<br>facilitando la comunicazione tra cellule epiteliali e monociti.<br>
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