• vie aeree
• infiammazione
• MCP-1
• IL-8
• chemochine
• istamina

Riassunto
Le microparticelle (MP) sono state descritte per la prima volta nel 1967
come frammenti di membrana cellulare presenti nel plasma umano.
Originariamente considerati artefatti in vitro o detriti cellulari privi di
significato fisiologico, in questi ultimi anni sono aumentate le evidenze
documentate di un ruolo delle MP stesse come modulatori di differenti
processi fisiopatologici come la coagulazione, le funzioni vascolari e
l¡¯infiammazione. In vitro, il rilascio delle MP pu¨° avvenire a partire da
diversi tipi cellulari stimolati o apoptotici (cellule endoteliali, piastrine,
leucociti, eritrociti) e l¡¯origine cellulare e la composizione delle MP
cambia come popolazione nelle varie condizioni patologiche. Le MP si
possono formare durante l¡¯attivazione cellulare attraverso diversi
meccanismi, ma in generale il rilascio di MP ¨¨ tempo e Ca2+ dipendente.
In vitro, l¡¯attivazione cellulare si pu¨° osservare in seguito a stimolazione
con diversi agonisti come trombina, calcio ionoforo, LPS, che
determinano aumento di Ca2+ citosolico, specialmente nel sito di
vescicolazione.
In un lavoro precedente svolto nel nostro laboratorio era stato dimostrato
che i monociti/macrofagi umani stimolati con il calcio ionoforo A23187
liberano MP con potenzialit¨¤ proinfiammatoria nei confronti dell¡¯epitelio
delle vie aeree. Lo scopo del mio progetto ¨¨ quello di verificare
l¡¯esistenza di stimoli fisiologicamente rilevanti in grado di produrre MP.
Tra i potenziali stimoli fisiologici si ¨¨ pensato all¡¯istamina. L¡¯istamina ¨¨
un¡¯ammina primaria accumulata in granuli di secrezione dei basofili e dei
mastociti ed ¨¨ implicata come mediatore nelle reazioni allergiche. In
particolare, tramite l¡¯attivazione dei recettori H1, esercita una gran variet¨¤
di effetti ed ¨¨ implicata in situazioni patologiche quali l¡¯asma bronchiale e
la rinite allergica, essa influenza inoltre la risposta del sistema
immunitario modulando l¡¯attivit¨¤ dei linfociti T, dei monociti e dei
macrofagi. Questo studio si prefissa quindi di esaminare il ruolo di basse
concentrazioni fisiologicamente rilevanti di istamina sull¡¯attivazione di
monociti/macrofagi e valutarne gli effetti sulla produzione di chemochine
proinfiammatorie quali IL-8 e MCP-1 da parte di cellule dell¡¯epitelio
delle vie aeree. A tale proposito sono stati fatti esperimenti in parallelo, in
cui lo stesso materiale, utilizzato per le analisi citofluorimetriche, ¨¨ stato
incubato con cellule di una linea cellulare, A549 (cellule neoplastiche in
coltura continua originariamente ottenute da un paziente affetto da
carcinoma bronchiolo-alveolare, che mantengono un fenotipo alveolare e
sono utilizzate come modello di epitelio delle vie aeree). I monociti sono
stati isolati da sangue periferico di donatori normali in seguito a
centrifugazione per gradiente con Ficoll/Histopaque e fatti aderire su
plastica per 18h. Il rilascio di MP da monociti aderenti ¨¨ stato stimolato
con istamina (30¦ÌM) per tempi diversi e il surnatante ¨¨ stato raccolto ed
utilizzato come stimolo sulle A549. Dopo 18h d¡¯incubazione, il mezzo
condizionato ¨¨ analizzato per il rilascio di IL-8 e MCP-1 con kit ELISA
disponibile commercialmente. Da esperimenti preliminari si osserva che
la concentrazione (pg/mL) nel mezzo condizionato delle A549 ¨¨ di 117,5
per le cellule non stimolate; 1524 e 2047 per le cellule incubate con il
surnatante di monociti non stimolati e stimolati con istamina (30¦ÌM) per
2h, rispettivamente. La filtrazione del surnatante di monociti stimolati con
istamina con un filtro da 0,22¦Ìm riduce la concentrazione a 1582,
dimostrando che l¡¯effetto ¨¨ in parte mediato da particelle corpuscolare e
non da molecole solubili; l¡¯azione diretta di istamina sulle A549 porta ad
un rilascio di IL-8 pari a 247,5 indicando che gli effetti non sono dovuti
appunto ad attivit¨¤ diretta dell¡¯istamina (dati di un esperimento
rappresentativo). Per quanto riguarda la sintesi di MCP-1, si hanno i
seguenti risultati (risultati espressi in pg/mL): Basale=421; Surnatante
non stimolato=630; Surnatante stimolato per 15¡¯ (MP)=811,5; Surnatante
stimolato ultrafiltrato(100kd cut off)=217,5; A549+ istamina=418(dati di
un esperimento rappresentativo). L¡¯attivazione cellulare mediata dal
recettore H1 ¨¨ confermata dal fatto che il rilascio di IL-8 e MCP-1 indotto
da istamina ¨¨ inibito in maniera concentrazione-dipendente da un agonista
selettivo per il recettore H1, la prometazina. I risultati ottenuti mediante
tecnica ELISA verranno affiancate a indagini molecolari allo scopo di
confermare che le variazioni di concentrazioni delle chemochine
riflettano le variazioni a livello trascrizionale. Da questo studio
preliminare, si pu¨° concludere che l¡¯istamina svolge, tra le altre,
un¡¯attivit¨¤ proinfiammatoria inducendo il rilascio di MP da parte dei
monociti. Queste rappresentano un meccanismo per amplificare la
concentrazione locale delle citochine infiammatorie e chemiotattiche
facilitando la comunicazione tra cellule epiteliali e monociti.