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La proteina traslocatrice di 18kDa, abbreviata TSPO, è una proteina composta da 5 domini alfa elica transmembranali ed è localizzata sulla membrana esterna dei mitocondri. A livello tissutale, si trova principalmente espressa a livello dei mitocondri delle cellule dei tessuti periferici. Tuttavia, è stata riscontrata la presenza di TSPO anche a livello del sistema nervoso centrale (SNC), seppur in quantità molto minori, in particolare in cellule gliali, quali astrociti e microglia. Nonostante i bassi livelli di espressione del TSPO a livello cerebrale, negli anni questa proteina ha suscitato molto interesse in quanto over-espressa durante vari processi neuropatologici (Papadopoulos V. et al., 2006).
Il TSPO è coinvolto in numerosi processi cellulari, come la biosintesi dell’eme e l’apoptosi, collaborando anche con altre proteine mitocondriali come VDAC (Voltage Dependent Anion Channel) e ANT (Adenine Nucleotide Transporter). Una delle principali funzioni attribuite al TSPO risulta però essere quella di riuscire a mediare il trasferimento del colesterolo (da qui il nome di proteina traslocatrice) dal citosol alla membrana interna mitocondriale, grazie alla sua caratteristica struttura a canale formata dalle cinque alfa eliche. Una volta all’interno del mitocondrio, il colesterolo viene metabolizzato a pregnenolone per azione dell’enzima CYP11A1. Questa conversione rappresenta il primo step di tutta la via biosintetica degli steroidi che, a livello cerebrale, prendono il nome di neurosteroidi. Numerose evidenze scientifiche hanno messo in relazione i ridotti livelli di neurosteroidi, con l’insorgenza di patologie di vario genere a carico del SNC, e come il ripristino di questi livelli possa alleviare tali quadri clinici, grazie anche ad un’azione GABAa mediata (Da Pozzo et al., 2012, rev). Il TSPO è stato quindi proposto come target farmacologico in quanto, una sua stimolazione tramite opportuni ligandi, potrebbe portare ad un aumento dei livelli di neurosteroidi, rappresentando un valido trattamento farmacologico per la cura di numerose patologie del SNC.
Negli anni, numerosi studi sono stati condotti per l’identificazione di ligandi in grado di stimolare l’attività del TSPO, sia endogeni, come ad esempio la protoporfirina IX e la Fosfolipasi A2, che di nuova sintesi. Inizialmente, il TSPO fu identificato come recettore periferico per le Benzodiazepine (PBR), poiché in grado di legare derivati benzodiazepinici, in particolare il derivato Ro5-4864. Da qui si è arrivati all’identificazione di nuovi ligandi sintetici; fra queste molecole ritroviamo ad esempio composti a struttura isochinolin-carbossammidici (PK11195) e derivati indolici (FGIN-1-27), che vengono considerati ligandi classici al TSPO.
Studi hanno dimostrato la presenza sul TSPO di due distinti siti di legame, parzialmente sovrapposti (Liu et al., 2014): un sito di legame per il PK11195 e uno per Ro5-4864. La presenza di questi due siti di legame distinti è stata determinata tramite l’utilizzo di tecniche di mutagenesi e da studi SAR (Structure-Activity Relationships). La scoperta e la caratterizzazione di queste due tasche è stata determinante nella sintesi di ulteriori ligandi al TSPO.
In questo lavoro di tesi sono state prese in considerazione due classi di ligandi del TSPO di nuova sintesi: AG5 (135,140,141,146) passabili di tutela brevettuale e LUC (1213,1309,1310,1311) caratterizzate da un nucleo fenil-indol-gliossi-ammidico tipico dei ligandi al TSPO PIGA. Entrambe le classi di composti sono state studiate per la loro capacità di legare il sito di legame del ligando classico PK11195. Sono stati svolti dei saggi di binding recettoriale per determinare l’affinità di questi composti con il TSPO. Il protocollo sperimentale ha previsto l’incubazione del ligando in opportuno tampone insieme a membrane di rene di ratto, precipitate e frazionate per isolare i mitocondri, e il ligando radiomarcato ([3H]PK11195). Dopo l’incubazione è stata svolta una filtrazione della miscela sottovuoto con filtri di lana di vetro, che ha permesso l’isolamento del complesso formato. Il filtro recuperato è stato analizzato tramite scintillatore in fase liquida da cui sono stati ottenuti i dpm. Sono state prese in considerazione diverse concentrazioni di ligando, e per ciascuna è stata calcolata la % di spiazzamento del radioligando dal sito di legame del PK11195. E’ stata quindi calcolata la concentrazione inibente il 50% dei recettori (IC50) per ogni composto e, grazie all’utilizzo dell’equazione di Cheng-Prusoff è stata ricavata anche la costante di inibizione (KI). I risultati ottenuti hanno dimostrato una buona affinità dei composti in esame, soprattutto della serie LUC, con KI dell’ordine del nM.
Visto la buona affinità dimostrata dai nuovi ligandi della serie LUC, è stato deciso di valutare tramite saggio ELISA competitivo la quantità di Pregnenolone rilasciato in seguito al trattamento, su cellule di glioblastoma umano U87-MG. Il trattamento con i ligandi ha confermato l’elevata capacità dei nuovi ligandi di stimolare la steroidogenesi in vitro.
Successivi studi in vivo saranno necessari a conferma dell’effetto osservato in vitro. Questi dati preliminari ci indirizzano comunque verso una prospettiva positiva di utilizzo dei nuovi ligandi del TSPO come possibili farmaci in trattamenti farmacologici per varie patologie a carico del SNC, sia di origine neurodegenerativa che psichiatrica