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Thesis etd-06192020-101344


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
MARCON, MADDALENA
URN
etd-06192020-101344
Thesis title
VALUTAZIONE DELLA CAPACITÀ STEROIDOGENICA IN CELLULE DI MICROGLIA UMANA IN CONDIZIONI INFIAMMATORIE
Department
FARMACIA
Course of study
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Da Pozzo, Eleonora
correlatore Dott. Germelli, Lorenzo
Keywords
  • steroidogenesi de novo
  • neurosteroidi
  • neuroinfiammazione
  • microglia
  • cyp11a1
  • tspo
Graduation session start date
08/07/2020
Availability
Withheld
Release date
08/07/2090
Summary
La microglia rappresenta uno degli elementi cellulari che costituiscono la componente gliale del sistema nervoso centrale (SNC), insieme ad astrociti e oligodendrociti. Le cellule di microglia vengono classicamente definite come macrofagi residenti del sistema immunitario, e svolgono un ruolo fondamentale all’interno del SNC a garanzia dell’omeostasi tissutale. Studi recenti hanno dimostrato che la microglia non è coinvolta solo nei processi correlati al sistema immunitario, ma svolge anche un ruolo fondamentale nello sviluppo del SNC stesso; è coinvolta infatti ad esempio nei fenomeni di plasticità neuronale, alla base delle normali funzioni cognitive e mnestiche di un individuo. Essendo però cellule del sistema immunitario, esse sono principalmente in grado di guidare la risposta infiammatoria, che si instaura in primo luogo per difendere i neuroni da danno cellulare di varia natura.
La microglia è infatti in grado di attivarsi, in seguito a differenti segnali derivanti dalle cellule adiacenti, e di rilasciare mediatori dell’infiammazione quali interleuchine (IL) 1β, IL-6, IL-8, chemochine e specie reattive dell’ossigeno (ROS). Durante questa fase, la microglia aumenta la propria capacità fagocitica con lo scopo di eliminare possibili componenti estranee e/o dannose.
Successivamente, in condizioni non patologiche, la microglia propende per un rilascio di interleuchine antiinfiammatorie, quali IL-4 e IL-10, per poi ritornare ad uno stato omeostatico.
Pertanto, se da una parte le funzioni della microglia attivata rappresentino un valido meccanismo di difesa per combattere i possibili danni in cui può incorrere il SNC, dall’altra un’eccessiva o inadeguata attivazione può portare essa stessa a condizioni patologiche. Infatti, processi infiammatori prolungati possono portare ad una condizione di neuroinfiammazione cronica, alla base di numerose patologie, sia neurodegenerative che psichiatriche. Studiare quindi i processi che portano all’attivazione/de-attivazione delle cellule di microglia permette di conoscerne più a fondo il funzionamento e di aprire la strada verso nuovi target farmacologici, la cui funzione potrebbe essere sfruttata per un’azione neuroprotettiva.
In tale ottica terapeutica, i neurosteroidi rappresentano una classe di molecole ad azione antiinfiammatoria e neuroprotettiva. Queste molecole sono prodotte de novo a partire dal colesterolo in cellule del SNC, in particolare in astrociti e neuroni; per quanto riguarda invece la microglia, non è ancora del tutto noto se la produzione de novo avvenga, o se alcuni neurosteroidi, precursori di altri, raggiungano la microglia attraverso il circolo ematico e/o linfatico. Tuttavia, in letteratura sono presenti alcuni studi condotti sulla microglia che dimostrano la presenza della proteina necessaria all’avvio della sintesi dei neurosterodi, la proteina traslocatrice mitocondriale (TSPO). Il TSPO, è una proteina presente sulla membrana esterna del mitocondrio, in grado di trasportare il colesterolo all’interno del mitocondrio stesso, dove viene metabolizzato a pregnenolone grazie all’enzima CYP11A1 o P450scc. Questa prima tappa di reazione è la tappa limitante la velocità per tutta la via biosintetica. Nel caso della microglia è stato osservato che, in seguito a infiammazione, i livelli di espressione del TSPO aumentano, ma non è ancora nota quale sia la portata della sua attivazione, se questo sistema si attivi per produrre neurosteroidi de novo e quanto effettivamente la sua attivazione porti alla risoluzione dell’infiammazione. (Werry et al, 2019 Selvaraj et al, 2016)
Il presente lavoro di tesi si è concentrato sulla valutazione dei livelli di espressione della via steroidogenica TSPO/CYP11A1 e della relativa produzione di pregnenolone, sia in condizioni basali, che infiammatorie, in cellule di microglia umana immortalizzate (cellule HMC3 e C20). I livelli di espressione sono stati analizzati sia tramite tecnica di Real-Time PCR per la valutazione dell’espressione genica, sia tramite tecnica Western Blot per quanto riguarda invece l’espressione delle proteine. Infine, l’effettiva produzione di Pregnenolone è stata valutata tramite tecnica ELISA competitivo. Sono stati inoltre testati sia ligandi classici del TSPO che ligandi di nuova sintesi, per valutarne l’efficacia nella stimolazione dell’attività steroidogenica delle cellule di Microglia.
I dati ottenuti dimostrano la presenza di TSPO e CYP11A1 in entrambe le linee cellulari, e quindi la possibilità per le cellule di microglia umana di fare steroidogenesi de novo. In particolare, l’espressione di queste due proteine sembra particolarmente aumentata in condizioni infiammatorie.
Tuttavia, l’effettiva produzione di pregnenolone risulta molto limitata, anche in condizioni infiammatorie nonostante l’aumento dei livelli di espressione. È stato riscontrato invece un significativo incremento della produzione di Pregnenolone in seguito a stimolazione farmacologica con ligandi del TSPO.
Possibili indagini future potranno essere la caratterizzazione di quali neurosteroidi siano prevalentemente prodotti dalle cellule di microglia umana e se la loro presenza sia in grado di attenuare uno stato infiammatorio indotto.
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