• Drop-off ; Digital PCR; IDH2
• AML ; CPX-351 ; Enasidenib

La Leucemia mieloide acuta (LMA) è una neoplasia clonale dei progenitori mieloidi del midollo osseo, estremamente eterogenea da un punto di vista genetico e fenotipico. Rappresenta la forma di leucemia acuta più frequente e ha un'incidenza rilevante soprattutto in America del Nord, Europa e Australia. Colpisce soprattutto individui al di sopra dei 65 anni. Le cause alla base di questa neoplasia sono ancora oggetto di dibattito ma entrano in gioco diversi fattori tra cui radiazioni, trattamenti chemioterapici, esposizione a sostanze chimiche e disordini ereditari. Clinicamente molto eterogenea, la leucemia acuta può presentarsi in maniera totalmente asintomatica, e quindi essere diagnosticata incidentalmente, ma quando è sintomatica, i sintomi ed i segni tipici sono legati alla insufficienza midollare che si viene a creare ed alla eventuale diffusione extra-ematologica.
Dal punto di vista citogenetico e molecolare, la LMA è caratterizzata sovente da anomalie cromosomiche, traslocazioni con la conseguente formazione di geni di fusione anomali e da mutazioni puntiformi o duplicazioni di sequenze. La caratterizzazione citogenetica e molecolare è fondamentale per una corretta gestione del paziente, poiché la classificazione basata su tali dati consente di avviare direttamente il paziente ad alto rischio al trapianto allogenico mentre ci si limita a consolidare quello a basso rischio.
Tra le numerose mutazioni conosciute si riscontrano anche quelle di IDH2; presenti nel 20% delle LMA “de novo” a cariotipo normale, la identificazione di tali anomalie genetiche è divenuta fondamentale per la recente disponibilità dell’inibitore Enasidenib.
Le mutazioni dei geni IDH1 e 2 avvengono nei loro siti attivi e i loro enzimi mutati non sono in grado di catalizzare le reazioni di decarbossilazione ossidativa. Il conseguente blocco di conversione dell'isocitrato in a-chetoglutarato nel ciclo di Krebs determina un aumento dei livelli di 2-idrossiglutarato il cui accumulo promuove effetti oncogenici ed inibisce la normale differenziazione cellulare e diverse attività enzimatiche, quali la idrossimetilazione del DNA TET2-dipendente, la demetilazione dell'istone e l'attivazione dell'HIF1A (fattore 1-alfa inducibile dall'ipossia), interferendo di fatto con il metabolismo cellulare e la regolazione epigenetica e giocando un ruolo fondamentale nell'oncogenesi.

L’obiettivo di questo lavoro è stata la messa a punto di una nuova PCR quantitativa, la drop-off digital droplet PCR (drop-off ddPCR), come strumento sensibile e preciso per rilevare le mutazioni di IDH2. Questa tecnica, diversamente dalla ddPCR "classica", è in grado di identificare tutte le possibili sostituzioni nucleotidiche sullo stesso codone in un'unica reazione, prestandosi pertanto ottimamente ad effettuare il test di screening alla diagnosi.
Nella seconda parte del nostro studio abbiamo confrontato la drop off ddPCR con il sequenziamento Sanger e la PCR quantitativa (ARMS PCR), mostrando una sensibilità comparabile tra ddPCR e PCR ARMS ed un evidente vantaggio rispetto al Sanger. Sono stati testati 60 pazienti con LMA; mentre il sequenziamento di Sanger ha identificato come pazienti mutati 8/60 (13,5%), sia ddPCR che la ARMS PCR hanno identificato mutazioni in 13/60 (21,6%) casi.
Infine, abbiamo valutato il possibile ruolo prognostico delle mutazioni di IDH2 nella nostra coorte di pazienti affetti da LMA, in termini di qualità della risposta al trattamento di induzione / consolidamento e come possibile strumento utile per monitorare la malattia minima residua (MRD).
Tuttavia, non abbiamo trovato alcuna differenza significativa in termini di qualità della risposta, sopravvivenza globale o sopravvivenza libera da progressione tra soggetti mutati e wild-type. Infine, abbiamo monitorato le mutazioni di IDH2 durante il follow-up in 9 casi mutati, dimostrando come le mutazioni di IDH2 possano essere considerate un buon marker di MRD in 2/3 dei pazienti.

In conclusione, il nostro studio ha confermato come la drop off ddPCR sia un metodo rapido, sensibile, quantitativo ed economico per la genotipizzazione di IDH2; il ruolo di IDH2 come marker di MRD rimane invece oggetto di dibattito