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Studio del controllo traduzionale mediato da microRNA dei geni Xotx2 e Xvsx1, responsabili del differenziamento dei neuroni bipolari retinici


Durante lo sviluppo embrionale i tessuti neurali si originano a partire da progenitori multipotenti che necessitano, per questo, di una regolazione integrata della proliferazione, dell’uscita dal ciclo cellulare e dell’attivazione di fattori coinvolti nel differenziamento cellulare.

La retina di Xenopus laevis è un modello ideale per lo studio della diversità cellulare poiché risulta costituita da sei principali tipi di neuroni (coni, bastoncelli, cellule orizzontali, amacrine, cellule bipolari) e un tipo di cellula gliare (glia di Müller) che sono facilmente riconoscibili grazie alla loro morfologia e localizzazione negli strati retinici e che si originano a partire da un singolo strato di progenitori multipotenti con una sequenza temporale ben definita e conservata evolutivamente.
In questo contesto, il destino cellulare è determinato dall’attivazione di geni specifici, tra cui i geni homeobox Xotx5 (fotorecettori), Xotx2 e Xvsx1 (cellule bipolari). L’attivazione di tali geni, così come atteso, segue la successione temporale con la quale i relativi tipi cellulari retinici vengono generati. Recentemente è stato dimostrato che l’attivazione di questi geni è regolata a livello traduzionale: i tre geni sono trascritti in tutti i progenitori precoci ma sono tradotti solo nelle cellule destinate a differenziare nel corrispondente tipo retinico, fotorecettori o cellule bipolari. Tale controllo traduzionale sembra essere effettuato da fattori che riconoscerebbero segnali in cis sul 3’ UTR degli mRNA.

I principali fattori, noti in letteratura, in grado di regolare la traduzione legando il 3’UTR dei messaggeri sono le proteine che legano l’mRNA (RBP) e i microRNA (miRNA). Nel mio lavoro di tesi ho studiato il possibile ruolo regolativo di cinque miRNA sui messaggeri dei geni homeobox Xotx2 e Xvsx1.

In primo luogo, per verificare se questi miRNA fossero effettivamente implicati nella downregolazione delle proteine dei geni Xotx2 e Xvsx1 ho effettuato esperimenti di perdita di funzione, utilizzando cinque oligonucleotidi modificati (Decoy) ognuno in grado di inibire un determinato miRNA. Ho innanzitutto lipofettato nelle vescicole ottiche di embrioni di Xenopus laevis a stadio 17-18 (st.17-18) i singoli Decoy assieme ad un costrutto plasmidico contenente GFP che permettesse di identificare le cellule lipofettate. Successivamente ho effettuato una conta per determinare le percentuali di cellule bipolari Xotx2 positive e Xvsx1 positive, identificate per mezzo di Immunostaining su sezione con i rispettivi anticorpi, rispetto al numero totale di cellule lipofettate.
In secondo luogo, sono stati utilizzati dei vettori contenenti il 3’UTR dei due geni clonati a valle della proteina fluorescente GFP (sensori) per verificare se effettivamente avvenisse l’interazione miRNA/mRNA.
Da una prima analisi dei dati ottenuti osserviamo che, in generale, i Decoy portano ad un forte incremento della percentuale delle cellule Xotx2 positive e in alcuni casi ad un incremento, un po’ più debole, delle cellule Xvsx1 positive, per cui sembra possibile affermare che il differenziamento delle cellule retiniche, in particolare delle cellule bipolari, è sottoposto ad un evidente controllo traduzionale da parte di miRNA. Inoltre l'esperimeto con i sensori mostra lo stesso effetto, ciò a dimostrazione di come la traduzione di questi due geni sia sottoposta al controllo di miRNA che agiscono sul 3'UTR dei trascritti.