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La Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO) è definita come una malattia comune, prevenibile e trattabile, caratterizzata da persistenti sintomi respiratori e limitazione al flusso aereo persistente, limitazione dovuta ad anomalie delle vie aeree e/o alveolari solitamente causate da una significativa esposizione a particelle nocive o gas, rappresentando oggi la terza causa di morte al Mondo. I fattori di rischio per lo sviluppo di BPCO risultano essere: fattori genetici; esposizione al fumo di tabacco; esposizione professionale; inquinamento dell’aria indoor; età avanzata, infezioni; asma; sesso, stato socioeconomico. I due quadri anatomo-patologici che rientrano nello spettro della BPCO sono la bronchite cronica e l’enfisema polmonare. La diagnosi di BPCO è spirometrica, esame da effettuare in tutti i pazienti sopra i 40 anni con esposizione ad uno dei fattori di rischio ed un quadro clinico compatibile. In passato, la BPCO era considerata come una malattia solamente limitata al polmone caratterizzata da una ostruzione persistente al flusso aereo mentre oggi si vede la BPCO sotto una nuova luce considerandola una malattia infiammatorie sistemica. Questo ci giustifica la forte associazione con una serie di comorbidità quali: fibrillazione atriale, insufficienza cardiaca congestizia, cardiopatia ischemica, diabete, malattia peptica, disturbo d’ansia, fibrosi polmonare, tumore del polmone, tumore del pancreas, tumore della mammella.
La BPCO è una malattia cronica caratterizzata da fasi di stabilità e fasi di riacutizzazioni definite come un peggioramento prolungato delle condizioni cliniche del paziente, oltre le normali variazioni quotidiane, con un esordio che può essere acuto e che richiede un aumento della terapia rispetto alla abituale. Il peggioramento delle condizioni cliniche del paziente comporta in genere un incremento della tosse, della quantità, viscosità e purulenza dell'espettorato, della dispnea ed un calo della saturazione ossiemoglobinica. Le riacutizzazioni di BPCO sono caratterizzata da uno stato infiammatorio e pro-trombotico ribattezzato stato trombo-infiammatorio. Negli ultimi anni è stato attribuito un ruolo alle vescicole extracellulari per la creazione di questo stato trombo-infiammatorio.
Le vescicole extracellulari sono delle particelle sferiche racchiuse da un doppio foglietto fosfolipidico, esse sono classificate in base alla loro dimensione in: esosomi (⌀=30-100 nm), microvescicole (⌀=100-1'000 nm), corpi apoptotici (⌀=1-3 µm). Il potenziale pro-trombotico delle vescicole extracellulari è dovuto alla loro espressione di una serie di fattori in grado di dare inizio alla via estrinseca della coagulazione: fosfolipidi carichi negativamente e fattore tissutale. L’attività pro-infiammatoria delle vescicole extracellulari è stata dimostrata da diversi studi, come ad esempio la produzione di marcatori della infiammazione come interleuchina-8 (IL-8), Intracellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) e Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) da parte di cellule epiteliali incubate con microvescicole stimolate con il fumo di sigaretta. Lo scopo della tesi è indagare l’eventuale ruolo pro-infiammatorio delle vescicole extracellulari circolanti in corso di riacutizzazione di BPCO. Dato che la risposta infiammatoria aumenta durante la fase di riacutizzazione, per poi ridursi progressivamente con l’allontanarsi dall’evento acuto ed il ritorno in fase stabile, l’ipotesi di lavoro è che le vescicole extracellulari circolanti possano esse stesse stimolare tale risposta infiammatoria. Per il presente studio è stato reclutato un campione conveniente di soggetti nel corso del protocollo denominato ANuBi (Analisi di Nuovi Biomarcatori nelle patologie respiratorie croniche) approvato dal Comitato Etico dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana il 10 dicembre del 2020, con primo paziente reclutato nell’aprile del 2021. ANuBi è uno studio prospettico che prevede per la partecipazione allo studio, dopo la firma di un consenso informato, i seguenti criteri di inclusione: pazienti con sospetta riacutizzazione di BPCO entro 48 ore dall’accesso nel Pronto Soccorso dell’Azienda Ospedaliera Universitario Pisana; pazienti con nota diagnosi di BPCO in fase stabile di malattia; soggetti di controllo (non affetti da BPCO) omogenei per età e sesso. Sono stati rispettati invece i seguenti criteri di esclusione: pazienti con patologia terminale, oncologica o meno con aspettativa di vita minore di 6 mesi; tumore attivo (ad es. tumore in terapia); arruolabili i pazienti in follow-up strumentale ma apparentemente liberi da malattia, che non fanno chemioterapia o altri trattamenti da almeno 6 mesi; nota grave patologia cardiovascolare di fondo (es. grave scompenso cardiaco – NYHA IV – aritmie instabili) o malattia cardiovascolare acuta (ad es. sindrome coronarica acuta, embolia polmonare); paziente con infezione in atto da SARS-CoV-2, accettabili pazienti guariti e negativi da almeno 3 mesi; diagnosi certa di asma bronchiale; Insufficienza renale cronica in dialisi; pazienti non in grado di eseguire una spirometria; pazienti non in grado di prestare valido consenso informato allo studio. I pazienti reclutati sono stati arruolati in uno studio osservazionale. Lo studio si compone di una componente prospettica e una trasversale. I soggetti sono stati sottoposti alle seguenti valutazioni, in base al ramo dello studio in cui sono stati coinvolti. Componente prospettica: A) Visita 0 (V0) con valutazione clinica entro 48 ore dalla ammissione al Pronto Soccorso dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana con diagnosi presuntiva di “riacutizzazione di BPCO”, comprensiva di: dati antropometrici e clinici basali (età, sesso, storia di fumo, comorbidità, terapia domiciliare, necessità di ventilazione non invasiva) e prelievo venoso ematico per l’isolamento ed il dosaggio delle vescicole extracellulari totali. Questo gruppo di pazienti sarà di seguito denominato R0. B) Visita 1 (V1): valutazione degli stessi soggetti a 8 settimane dalla riacutizzazione di BPCO. I pazienti sono stati sottoposti ad una visita ambulatoriale comprensiva di: anamnesi, esame obiettivo, compilazione di questionari sulla dispnea (scala Medical Research Council modificata, mMRC) e sui sintomi (COPD Assessment Test, CAT) [1], prove di funzionalità respiratoria (curva-flusso volume forzata per conferma della diagnosi e stadiazione della gravità dell’ostruzione al flusso, secondo le linee guida ATS[1]), prelievo ematico per l’isolamento ed il dosaggio delle vescicole extracellulari totali. I pazienti in cui la diagnosi di BPCO è stata confermata sono stati denominati R1; coloro che, al contrario, non presentavano ostruzione al flusso alla spirometria sono usciti dallo studio. Componente trasversale: A) Visita 1 (V1): i soggetti (pazienti con BPCO in fase stabile e soggetti di controllo) sono stati sottoposti ad una visita ambulatoriale comprensiva di: anamnesi, esame obiettivo, compilazione di questionari sulla dispnea (scala Medical Research Council modificata, mMRC) e sui sintomi (COPD Assessment Test, CAT) [1], prove di funzionalità respiratoria (curva-flusso volume forzata per conferma della diagnosi e stadiazione della gravità dell’ostruzione al flusso, secondo le linee guida ATS[1]), prelievo ematico per l’isolamento ed il dosaggio delle vescicole extracellulari totali. I pazienti con diagnosi di BPCO sono stati denominati S, i soggetti di controllo sono stati denominati C.
In totale, sono stati reclutati 29 pazienti così suddivisi: 12 pazienti con diagnosi certa di riacutizzazione di BPCO; 12 pazienti con diagnosi di BPCO in fase di stabilità; 5 soggetti di controllo. I risultati di questa tesi di laurea possono essere riassunti come segue: la concentrazione di vescicole extracellulari totali circolanti è significativamente più elevata nel gruppo di soggetti in fase di riacutizzazione di BPCO rispetto al gruppo di soggetti in fase di stabilità di malattia (p<0,01) e rispetto al gruppo di controllo (p=0,004). Al contrario, la differenza tra la concentrazione di vescicole extracellulari totali circolanti tra il gruppo di soggetti in fase di stabilità di malattia (S) ed il gruppo di soggetti di controllo (C) non ha raggiunto la significatività statistica (p=0,112). Si osserva una concentrazione statisticamente e significativamente più elevata di vescicole extracellulari totali circolanti in fase di riacutizzazione di BPCO rispetto a 8 settimane dopo la riacutizzazione di BPCO (p=0,002). Si osserva che i valori di IL-8 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate con vescicole extracellulari circolanti prelevate nel gruppo di pazienti riacutizzati sono significativamente più elevati rispetto alla produzione di IL-8 da parte di cellule epiteliali stimolate da vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di pazienti stabili (p=0,004) ed ai valori di IL-8 prodotti da cellule epiteliali stimolate da vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di soggetti sani di controllo (p=0,010), mentre non viene raggiunta una differenza statisticamente significativa tra livelli di IL-8 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate da vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di soggetti in fase di stabilità di malattia rispetto ai valori prodotti da cellule epiteliali stimolate con vescicole extracellulari prelevate nel gruppo di soggetti sani di controllo (p=0,083). Risultati sovrapponibili si ottengono per quanto riguarda l’altra citochina pro-infiammatoria presa in esame, ovvero MCP-1: si osserva che i valori di MCP-1 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate con vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di pazienti riacutizzati sono significativamente più elevati rispetto ai valori di MCP-1 prodotti da parte di cellule epiteliali stimolate con vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di pazienti in fase di stabilità di malattia (p=0,019) ed ai valori di MCP-1 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate con vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di soggetti sani di controllo (p=0,023), mentre non viene raggiunta una differenza statisticamente significativa tra livelli di MCP-1 prodotti da parte di vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di pazienti in fase di stabilità di malattia rispetto a i valori di MCP- 1 prodotti da vescicole extracellulari totali circolanti prelevate nel gruppo di soggetti sani di controllo (p=0,494). Si osserva che i valori di IL-8 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate da vescicole extracellulari totali circolanti prelevate al momento della riacutizzazione di BPCO sono significativamente più elevati rispetto ai valori di IL-8 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate dalle vescicole prelevate 8 settimane dopo la riacutizzazione di BPCO (P=0,008). Analogamente, i valori di MCP-1 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate da vescicole prelevate al momento della riacutizzazione di BPCO sono significativamente più elevati rispetto ai valori di MCP-1 prodotti dalle cellule epiteliali stimolate da vescicole prelevate 8 settimane dopo la riacutizzazione di BPCO (p=0,039). Il principale punto di forza del presente studio è rappresentato sicuramente dai risultati originali per quanto riguarda la dimostrazione della attività pro-infiammatoria delle vescicole extracellulari totali circolanti, specie per quanto riguarda il gruppo di pazienti riacutizzati. Tali valutazioni sono state rese possibile grazie all’utilizzo di un modello di biologia cellulare ormai consolidato, visto che è già stato altre volte in passato dallo stesso gruppo di ricerca. Questo risultato apre alla possibilità di indagare un campo finora poco esplorato, ossia quello delle vescicole extracellulari come attori attivi nella biologia di almeno alcuni aspetti della BPCO, mentre finora esse sono state abbastanza estesamente indagate semplicemente come potenziali biomarcatori. Ovviamente, questo potrebbe rappresentare un passo nella comprensione di alcuni meccanismi di malattia, con potenziali implicazioni anche per lo studio di specifici trattamenti mirati ad interferire con gli aspetti di tali meccanismi più dannosi pe il paziente. Tuttavia, lo studio presenta alcuni limiti, primo tra tutti sicuramente la numerosità campionaria. Lo studio è condotto sua una popolazione composta da un numero limitato di pazienti. Per questo motivo sarà necessario in futuro confermare tali dati su un numero campionario maggiore. I risultati ottenuti dal presente studio, seppure con i limiti sopra descritti, mostrano come le vescicole extracellulari possono svolgere un ruolo biologico come effettori di malattia nell’indurre la risposta infiammatoria che caratterizza la fase di riacutizzazione e può essere confermato il loro utilizzo come marcatori di malattia in corso di BPCO. In futuro, potrebbe essere interessante ripetere lo stesso disegno del presente studio valutando la concentrazione e l’attività pro-infiammatoria non solo delle vescicole extracellulari totali circolanti, ma anche delle singole popolazioni di vescicole extracellulari in base alla loro origine cellulare o alle loro dimensioni.