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Le piante medicinali sono state oggetto dell’interesse dell’uomo sin dall’antichità e ancora oggi nonostante l’avvento della chimica di sintesi, la maggior parte delle medicine utilizzate deriva direttamente o indirettamente dal mondo vegetale. Infatti, molte sostanze un tempo estratte dalle piante hanno ceduto il passo a molecole di sintesi, a volte più efficaci e sicuramente più economiche da produrre. In altri casi invece, il ritorno alle molecole naturali ha determinato una rivalutazione di alcuni principi attivi di sintesi, non più efficaci o con preoccupanti effetti collaterali (Maffei, 1999).
I principi attivi, i responsabili dell’attività curativa delle piante, sono prodotti del metabolismo secondario e la loro sintesi non è altro che l’attuazione di una strategia di difesa della pianta in seguito al verificarsi di condizioni avverse come fattori di stress, patogeni o predatori.
La coltura in vitro di piante medicinali ha assunto grande importanza soprattutto per quelle specie, tra cui l’Echinacea angustiflolia D.C., che presentano problemi di propagazione classica o per le quali la produzione agricola non riesce a soddisfare la domanda del mercato, in quanto permette di ottenere, in maniera continua ed indipendente dalle condizioni ambientali, piante selezionate per le caratteristiche dei loro principi attivi.
La specie officinale oggetto della presente tesi sperimentale è l’Echinacea angustifolia D.C., coltivata principalmente per la presenza di derivati dell’acido caffeico, alchilammidi, flavonoidi e polisaccaridi nella droga, che è costituita in prevalenza da radici e rizomi. Tali composti presentano una comprovata attività immunostimolante, antibatterica, antimicotica, antivirale, antinfiammatoria ed antiossidante.
Lo scopo della seguente tesi è quello di realizzare dei sistemi di coltivazione in vitro per la produzione di biomassa di Echinacea angustifolia D.C. e di valutarne l’efficienza per poter realizzare una produzione di metaboliti secondari con metodi economicamente convenienti.
In particolare, è stata messa a punto l’induzione di callo su substrati solidi in diverse condizioni ambientali caratterizzando le colture ottenute tramite la realizzazione di curve di crescita.
Inoltre, poiché dalla letteratura emerge che in molti casi la produzione di metaboliti secondari è strettamente associata al grado di differenziazione dei tessuti, si è voluto indagare se colture di callo di Echinacea angustifolia D.C. in rigenerazione (ovvero masse di cellule in attiva crescita che presentano dei centri di differenziazione con apici vegetativi e primordi fogliari) fossero più idonee alla realizzazione di colture liquide per l’estrazione di principi attivi.
Si è quindi avviato un sistema di coltura cellulare su substrati liquidi osservando l’andamento della crescita del callo nelle diverse condizioni testate.
Tenendo in considerazione che i principi attivi presenti in questa specie sono di interesse nutraceutico, si è cercato di mettere a punto anche un sistema colturale che prevedesse l’utilizzo minimo di fitoregolatori e l’uso alternativo di sostanze naturali come il latte di cocco.
Infine, la biomassa ottenuta in vitro è stata caratterizzata eseguendo un’indagine qualitativa preliminare sul contenuto in clorofilla, xantofille, carotenoidi, antocianine e flavonoli ed è stata effettuata una valutazione dell’attività antiossidante degli estratti al fine di stabilire quale dei sistemi di coltura adottati e quale dei substrati agarizzati e liquidi utilizzati, sia in grado di produrre biomassa con un elevato contenuto di sostanze d’interesse per l’industria alimentare e farmaceutica.
I risultati delle prove effettuate nell’ambito di questa tesi hanno dimostrato l’attitudine di questa specie alla coltivazione in vitro.
E’ stato possibile infatti, partendo da porzioni di lamina fogliare, ottenere callo attraverso l’induzione di proliferazione di cellule indifferenziate su un substrato SC (composto da: macro e micro elementi MS (Muraschige & Schoog,1962), vitamine B5 Gamborg (Gamborg, 1968), 2 mg/l BA (6-bezylaminopurine) e 2 mg/l NAA (1-naphthaleneacetic acid) al buio. L’uso del substrato Ch 0,5 BA contenente sostanze citochininiche (0,5 mg/l BA) ha indotto un processo di differenziazione nei tessuti, messo in luce prima dalla comparsa di aree pigmentate e successivamente di apici e primordi fogliari visibili. Queste colture sono cresciute attivamente soprattutto in presenza di luce dando origine ad una biomassa superiore al callo indifferenziato cresciuto sul substrato SC.
Dalle curve di crescita delle colture su substrato liquido in agitazione (sistema chiuso di coltura cellulare in cui le masse di tessuto ed il substrato sono stati rinnovati ogni tre settimane) è emerso che si ha una crescita maggiore rispetto ai mezzi solidi ed in particolare l’aggiunta di latte di cocco ha indotto un’accelerazione e un aumento della crescita cellulare.
I risultati ottenuti hanno quindi dimostrato che il latte di cocco può essere utilizzato come alternativa all’uso dei fitoregolatori.
Dalle analisi eseguite sul materiale vegetale coltivato in vitro è emerso che il callo cresciuto sul mezzo SC, pur non mostrando alcun grado di differenziazione, ha in generale un basso contenuto di metaboliti. Invece, le biomasse rigeneranti mostrano un contenuto di flavonoli ed antocianine considerevole e sono in grado di svolgere una buona attività antiossidante.
In conclusione è stato possibile realizzare dei sistemi di coltura liquida di biomasse rigeneranti che hanno mostrato buone potenzialità come strumenti per la produzione dei metaboliti secondari.