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• CRISPR-Cas
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La proteina fibrillare acida della glia (GFAP) è il principale filamento intermedio degli astrociti maturi, la cui anomala presenza nel torrente circolatorio è indicativa della presenza di danni agli stessi e dell’alterazione dell’integrità della barriera ematoencefalica (BBB, blood-brain barrier). Per questo è stata proposta come biomarcatore di traumi cranici (TBI, traumatic brain injuries), emorragie intracerebrali o patologie neoplastiche come il glioblastoma multiforme (GBM). Inoltre, recentemente è stato proposto l’uso di microRNA (miRNA) extracellulari come potenziali biomarcatori tumorali. Recenti studi hanno dimostrato come i miRNA siano coinvolti nell’inizio e nella progressione di numerosi tipi di cancro e come l’alterazione della loro espressione sia correlata a particolari stadi dello sviluppo tumorale. In particolare, miRNA21 (miR-21) è stato proposto per la diagnosi precoce di vari tipi di neoplasie (GBM, polmonare, pancreatico ecc.). Data la presenza di questi due biomarcatori nei fluidi biologici, i pazienti usufruire di una semplice analisi del sangue per la diagnosi di neoplasie. Per tale rilevazione è possibile sfruttare i biosensori, dispositivi capaci di rilevare un analita (acidi nucleici, proteine, microrganismi, polisaccaridi ecc.) tramite elementi molecolari di riconoscimento. Essi convertono la presenza dell’analita in un segnale rilevabile, quantificabile ed analizzabile. Fra gli strumenti diagnostici attualmente a disposizione, i biosensori possiedono il potenziale per una rilevazione rapida, accurata e non invasiva, per questo il loro sviluppo sta acquisendo sempre maggior interesse in campo biomedico.
Durante il mio lavoro di tesi ho partecipato allo sviluppo di due sistemi di rilevazione biomolecolare per l’identificazione di biomarcatori in fluidi biologici: uno per GFAP ed uno per miR-21. Per gli esperimenti ho utilizzato una microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D). Con questo strumento ho valutato l’adesione di molecole sulla superficie dorata del sensore, quindi l’efficacia di rilevazione degli analiti da parte di diversi tipi di funzionalizzazioni.
Per l’analita GFAP, il sistema di rilevazione comprende superficie in oro funzionalizzata con diversi tipi di sonde terminanti con anticorpi anti-GFAP. Le diverse strategie di funzionalizzazione sono state denominate F1A/F1B, F2 ed F3 e sfruttano diversi metodi di immobilizzazione dell’anticorpo: le sonde F1 si basano sulla presenza di una molecola di PEG, nota per le sue proprietà antifouling ed usata per ridurre il segnale aspecifico; le sonde F2 si basano sull’immobilizzazione tramite proteina G, per un maggior controllo sull’orientamento dell’anticorpo; le sonde F3 sono composte da anticorpi ridotti direttamente adesi sulla superficie. In seguito a preliminari misure in PBS svolte dal gruppo di ricerca, per studiare le capacità dei diversi sistemi di rivelazione in un ambiente più complesso, ho svolto misure in siero fetale bovino (FBS), con concentrazioni crescenti di GFAP (da 2.2 pM fino a 2.2 μM). Tra le strategie da me testate in FBS (F1B, F2 e F3), solo F3 ed F2 hanno fornito segnale sufficiente per poter ricavare un limite di rilevazione (LOD). F1A ha fornito un LOD di 86 nM, ricavato in esperimenti precedenti effettuati dal gruppo di ricerca, maggiore delle altre strategie ma con migliore significatività statistica. Inoltre, F2 si è rilevato incapace di impedire il legame aspecifico di altre molecole contenute nel campione. Di conseguenza, F1A è stata la tecnica di elezione per i successivi esperimenti con campioni di siero murini, modello di GBM. Questi campioni sono stati ottenuti da topi sottoposti a trapianto intracranico di cellule di GBM, con prelievi effettuati a diversi stadi dello sviluppo tumorale, in modo da seguire l’andamento temporale dei marcatori. Su questi campioni ho svolto un esperimento preliminare, i cui risultati suggeriscono la capacità di F1A di riconoscere specificatamente la GFAP all’interno del siero murino, in maniera proporzionale al volume del glioma. Sono però necessari ulteriori esperimenti che confermino i risultati ottenuti.
Parallelamente, ho preso parte alla progettazione di sistema di rilevazione biomolecolare per l’identificazione di miRNA21 (miR-21) in fluidi biologici, sfruttando il sistema CRISPR-Cas9. Il complesso enzimatico consta di una endonucleasi (Cas9) ed un RNA guida (gRNA) con sequenza complementare al dsDNA bersaglio, dove induce un taglio del doppio filamento in presenza della sequenza PAM (Protospacer-Adjacent Motif) 5′-NGG-3′. In aggiunta, ho sviluppato sonde per un sistema di recente scoperta, il sistema CRISPR-Cas12a, in grado di attuare un taglio “collaterale” su DNA a singolo filamento (ssDNA) non-bersaglio in seguito al riconoscimento della sequenza bersaglio (dsDNA) dotata di PAM (5′-TTN-3′). Infine, ho dimostrato la capacità del sistema CRISPR-Cas9, dotato di un gRNA complementare al miR-21, di riconoscere e tagliare un plasmide contenente la sequenza bersaglio in vitro, tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio.
In conclusione, F1A viene ulteriormente confermata come la tecnica di immobilizzazione con le maggiori capacità di rilevazione di GFAP in ambienti complessi come il siero, riuscendo a rilevare concentrazioni maggiori o uguali a 86 nM, probabilmente grazie alle proprietà antifouling del PEG e della specificità dell’anticorpo utilizzato. Questo metodo di rilevazione biomolecolare potrebbe quindi essere un candidato ideale per lo sviluppo di biosensori di carattere diagnostico. Per quanto riguarda il sistema di rivelazione biomolecolare CRISPR, se i risultati sperimentali daranno esito positivo, tale sistema potrebbe essere sfruttato non solo per miR-21, ma anche per la rivelazione di altri miRNA proposti come biomarcatori tumorali e presenti nei fluidi biologici. In questo modo, si potrebbe pensare allo sviluppo di un dispositivo biosensoristico non solo a scopo diagnostico, ma anche prognostico e di monitoraggio per pazienti già affetti da neoplasie, che fornisca risultati accurati e rapidi grazie alla rivelazione di diversi biomarcatori.