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Thesis etd-06122023-110458


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
CRISPINO, ENRICO
URN
etd-06122023-110458
Thesis title
Sintesi di nuovi inibitori di metalloproteasi batteriche a struttura N-benzilossi amminoacidica potenzialmente attivi contro le infezioni batteriche
Department
FARMACIA
Course of study
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Nuti, Elisa
relatore Dott. Di Leo, Riccardo
Keywords
  • metalloproteasi batteriche
  • termolisina
  • pseudolisina
Graduation session start date
12/07/2023
Availability
Withheld
Release date
12/07/2026
Summary
Le infezioni batteriche rappresentano al giorno d’oggi una delle maggiori problematiche per la sanità e la salute a livello globale. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha emesso un avviso secondo cui nei prossimi anni le infezioni e le ferite minori saranno una delle principali cause di mortalità. Tale emergenza è correlabile alle infezioni acquisite in ospedale o in ambienti sanitari, definite infezioni nosocomiali (NIs). Le NIs sono causate dai batteri “ESKAPE”, ovvero: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonie, Acinetobacter bau mannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp che sono resistenti agli antibiotici. Particolare attenzione è stata rivolta verso le infezioni dovute ai batteri Gram negativi. Infatti, quest’ultimi hanno mostrato una notevole resistenza ai classici antibiotici e pertanto, lo sviluppo di nuovi agenti antibatterici con un meccanismo d’azione alternativo potrebbe essere di cruciale importanza.
Negli ultimi anni, c’è stato un crescente interesse della ricerca verso le zinco-metalloproteinasi batteriche ed in particolare verso la termolisina (TLN) e pseudolisina (PLN), enzimi appartenenti alla famiglia M4 delle metalloproteinasi. TLN e PLN sono due fattori di virulenza, secreti da batteri Gram-negativi o Gram-positivi, implicati nella degradazione di proteine e peptidi extracellulari utili per la nutrizione e sporulazione dei batteri. Come tali costituiscono un interessante bersaglio d’azione da sfruttare per sviluppare inibitori ed evitare il fenomeno della multi-resistenza batterica (MDR). Questi enzimi hanno un’alta omologia strutturale tra di loro e presentano all’interno del loro sito catalitico uno ione Zn2+ coordinato da due istidine, da un residuo di acido glutammico e da una molecola d’acqua. Inoltre, il sito catalitico contiene tre diversi sottositi (S1’, S1 e S2’) i quali si differenziano per forma, dimensione e polarità. Particolare attenzione è stata rivolta verso la tasca S1’, la quale può rappresentare un fattore di selettività per lo sviluppo di inibitori, in quanto possiede una forma e profondità diversa tra le varie metalloproteinasi.
Attraverso uno screening enzimatico, il composto a struttura N-benzilossi aminoacidica LM-2, sintetizzato dal gruppo di ricerca nel quale ho svolto la mia Tesi di Laurea, è stato selezionato come hit compound. Infatti, LM-2 ha mostrato una buona attività e selettività verso la TLN (IC50=9.5μM) e PLN (IC50=1.9μM) rispetto alle metalloproteinasi endogene come le metalloproteasi della matrice extracellulare (MMPs) e le A disintegrine e metalloproteasi (ADAMs). Inoltre tramite studi di docking condotti su LM-2 nel sito catalitico della pseudolisina si è evidenziato che il ligando chela lo ione Zn2+ attraverso il gruppo idrossammato, mentre il sistema aromatico occupa la sottotasca-S2’ e la catena alchilica n-butilica punta verso la sottotasca-S1’ la cui apertura è limitata da un residuo di arginina (R198).
Alla luce di queste considerazioni, il progetto di Tesi si è focalizzato sulla progettazione di acidi idrossammici analoghi al composto LM-2 cercando di migliorarne l’affinità e la selettività verso TLN e PLN. A tal proposito è stata sintetizzata una prima serie di composti in maniera tale da effettuare uno studio preliminare di SAR su questa classe di molecole.
In particolare, la catena n-butilica in alfa al gruppo idrossammato è stata sostituita con catene portanti acidi carbossilici, esteri o gruppi peptidici, cercando di instaurare maggiori interazioni con il sottosito-S1’, ed in particolare con l’arginina 198. Inoltre, è stato introdotto un atomo di cloro in posizione para sul sistema aromatico per valutarne la sua influenza nella tasca S2’.
Infine, recenti studi di docking hanno indicato che l’enantiomero S del composto LM-2 risulta interagire meglio con l’enzima rispetto al corrispettivo enantiomero R. Sulla base di questi dati sono stati sintetizzati composti di configurazione S che portano catene alchiliche lineari di diversa lunghezza in alfa al gruppo idrossammato ed un gruppo N-benzilico al posto del sostituente N-benzilossi amminico che era presente in LM-2. Quest’ultima modifica è stata effettuata per impedire al sistema aromatico di andare in profondità nella tasca S1’ delle MMPs, cercando di aumentare la selettività verso TLN e PLN.
Infine, i nuovi derivati sintetizzati verranno testati attraverso un saggio spettrofluorimetrico dal gruppo di ricerca del Prof. Ingebrigt Sylte, Department of Medical Biology, The Arctic University of Norway, per valutare la loro attività inibitoria e selettività verso gli enzimi batterici.


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