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Tesi etd-06092020-174640


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM6
Author
MENCARELLI, PIETRO ELIA
URN
etd-06092020-174640
Title
L'influenza di Sirt-1 sulla regolazione di p66Shc, dello stress ossidativo mitocondriale e della funzione endoteliale nel paziente obeso
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Supervisors
relatore Prof. Taddei, Stefano
correlatore Prof. Masi, Stefano
Parole chiave
  • oxidative stress
  • sirt-1
  • sirtuins
  • sirtuine
  • endothelial dysfunction
  • disfunzione endoteliale
  • Obesity
  • mtROS
  • p66Shc
  • Obesità
Data inizio appello
20/07/2020;
Consultabilità
Secretata d'ufficio
Data di rilascio
20/07/2090
Riassunto analitico
La prevalenza e l’incidenza dell’obesità sono in costante aumento in molte parti del mondo, tanto da poter parlare di una vera e propria epidemia. Nel 2015 si stima che 720 milioni di individui al mondo fossero obesi, e rispetto ai dati raccolti nel 1980 la prevalenza è raddoppiata in più di 70 paesi.
L’obesità è strettamente associata ad elevato rischio di mortalità e morbilità, principalmente dovute a patologia cardiovascolare. Infatti, sebbene per anni si sia assistito ad una riduzione della mortalità per cause cardiovascolari, nell’ultimo decennio si è assistito ad un brusco arresto di tale andamento, che si ritiene essere legato alla rapida diffusione dell’obesità a livello mondiale.
L’obesità comporta la generazione di un microambiente infiammatorio, l’insorgenza di insulino resistenza e un aumentato stress ossidativo, questi sono i principali fattori responsabili dello sviluppo di disfunzione endoteliale, l’alterazione più precoce osservabile nell’evoluzione del processo aterosclerotico. L’NO (ossido nitrico) è un elemento fondamentale nella modulazione della funzione endoteliale, e nei pazienti obesi si riscontra un calo della sua produzione sia per un calo nella sua sintesi sia per un aumentato catabolismo; ciò rappresenta un elemento chiave nell’acquisizione del fenotipo endoteliale disfunzionante.
Una delle più importanti molecole che intervengono nel modulare la biodisponibilità di NO è Sirt-1, proteina facente parte della famiglia delle sirtuine, proteine con attività di istone deacetilasi NAD+ dipendenti che sono coinvolte in numerosi processi biologici: sopravvivenza cellulare, senescenza, proliferazione, apoptosi, riparazione del DNA e metabolismo cellulare. La dipendenza di Sirt-1 dalla concentrazione di NAD+ intracellulare rende la loro attività dipendente dallo stato energetico della cellula. In condizioni di deficit energetico, Sirt-1 va incontro ad iperattivazione, mentre la sua attività risulta deficitaria in caso di eccesso energetico (come nel caso dell’obesità); le sirtuine si traducono così in sensori metabolici che influenzano la trascrizione cellulare in dipendenza dallo stato energetico della cellula.
Sirt-1 è in grado di deacetilare eNOS iperattivandola e di modulare i livelli di stress ossidativo sia a livello citoplasmatico sia mitocondriale. Esperimenti animali hanno mostrato una inibizione da parte di Sirt-1 su p66Shc , una proteina in grado di aumentare la produzione di radicali liberi dell’ossigeno mitocondriali (mtROS). Quindi, un deficit di Sirt-1, quale quello osservato in condizioni di eccesso di substrati energetici, potrebbe tradursi in un’ecessiva produzione di mtROS, e conseguente compromissione della funzione endoteliale.
Questa tesi ha lo scopo di valutare l’influenza di Sirt-1 nel controllo dei mtROS tramite p66Shc nel paziente anziano ed obeso, e di fornire una stima quantitativa del contributo che lo stress ossidativo mitocondriale ha nella fisiopatogenesi della disfunzione endoteliale in questi pazienti.
Nello studio sono stati reclutati un totale di 47 pazienti obesi e 48 non-obesi. Il gruppo dei soggetti obesi era costituito da pazienti che dovevano sottoporsi a chirurgia bariatrica elettiva mentre il gruppo dei soggetti di controllo risultava costituito da pazienti che si erano sottoposti ad interventi di colecistectomia o ernia inguinale in elezione. Considerando il fatto che l’attività di Sirt-1 e la produzione di mtROS si modificano con l’età, sia il gruppo degli obesi sia il gruppo dei controlli sono stati suddivisi ulteriormente in due sottogruppi sulla base dell’età maggiore o minore dei 40 anni. In questo modo sono stati creati quattro gruppi di pazienti:
• YNw: non obesi con età< 40 anni.
• ONw: non obesi con età> 40 anni.
• YOb: obesi con età< 40 anni.
• OOb: obesi con età> 40 anni.
Durante l’intervento chirurgico di ciascun paziente è stata prelevata una piccola quantità di tessuto adiposo sottocutaneo da cui sono state successivamente isolate arteriole di resistenza le cui estremità sono state successivamente montate su di un miografo a pressione per la determinazione delle caratteristiche strutturali delle arteriole ed un successivo studio della funzione endoteliale tramite curve dose-risposta all’acetilcolina (Ach) aggiunta all’arteria immediatamente o successivamente all’incubazione con reagenti dotati di diverse proprietà biologiche: SRT1720 (agonista di Sirt-1), L-NAME (inibitore di eNOS), MitoTEMPO (scavenger dei mtROS) e gp91 ds-tat (NADPH ossidasi inibitore).
Inoltre, subito dopo l’isolamento, le arteriole di 10 soggetti obesi e di 10 non-obesi sono state incluse in OCT e congelate a -80°C per l’esecuzione di successivi esperimenti di fluorescenza al microscopio confocale volti a definire la produzione di mtROS (tramite la sonda fluorescente MitoSOX Red) e di NO (tramite l’utilizzo della sonda fluorescente DAF-FM). Inoltre, 3 arteriole ottenute da pazienti obesi sono state sezionate per ottenere 2 segmenti del vaso. Un segmento è stato immediatamente incluso in OCT mentre l’altro segmento è stato incubato overnight con l’agonista selettivo di Sirt1, SRT1720. Questi segmenti sono stati poi processati per la colorazione con MitoSOX red e DAF-FM per dedurre l’effetto sulla produzione di mtROS e NO derivante dalla riattivazione del segnale di Sirt1.
La possibile influenza sulla regolazione epigenetica di p66Shc da parte di Sirt-1 è stata testata sulle arteriole di pazienti obesi (n=18) e controlli (n=18) tramite immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Infine, per confermare una possibile influenza di Sirt1 sull’espressione di p66Shc, 5 arteriole ottenute da pazienti obesi sono state sezionate per ottenere 2 segmenti del vaso. Uno dei segmenti vascolari è stato immediatamente congelato in azoto liquido mentre l’altro è stato incubato per 24 ore con l’agonista selettivo di Sirt1, SRT1720; l’espressione di p66Shc è stata poi valutata sia sui segmenti congelati immediatamente, sia su quelli congelati dopo incubazione tramite qPCR. Queste ultime analisi si sono svolte presso il Laboratorio di Cardiovascular Epigenetics & Regenerative Medicine dell’università di Zurigo, diretto dal Prof Francesco Paneni.
I pazienti obesi presentavano un’espressione di Sirt-1 a livello della parete vascolare significativamente inferiore rispetto a quella riscontrata nei soggetti non obesi a cui si accompagnava un ridotto legame di Sirt-1 a livello della regione promoter di p66Shc. Come conseguenza, l’espressione di p66Shc a livello della parete vascolare dei pazienti obesi risultava significativamente superiore rispetto ai non obesi. Inoltre, l’elevata espressione di p66Shc aveva importanti ripercussioni sui livelli di mtROS e NO della parete vascolare. Infatti, i livelli di mtROS risultavano progressivamente più elevati mentre quelli di NO progressivamente più bassi passando dai gruppi YNw, ONw, YOb, OOb. L’effetto di possibile controllo da parte di Sirt-1 su p66Shc e quindi sulla produzione di mtROS, era confermato dal fatto che, l’incubazione delle arteriole per 24 ore con l’agonista selettivo per Sirt-1 (SRT1720) era in grado di ridurre significativamente i livelli di mtROS rilevabili in microscopia confocale.
La risposta vasodilatatoria all’acetilcolina risultava minore nei soggetti adulti rispetto ai giovani e negli obesi rispetto ai controlli. La preincubazione con SRT1720 migliorava significativamente la funzione endoteliale in tutti i gruppi eccetto i YNw; la preincubazione con L-NAME era in grado di abolire la risposta vasodilatatoria indotta da SRT1720, suggerendo che il suo effetto fosse dovuto, almeno in parte, da un controllo sulla biodisponibilità di NO. La preincubazione con gp91ds-tat migliorava la funzione vascolare negli obesi e nei soggetti in età adulta ma in modo minore rispetto all’azione di SRT1720. Al contrario l’incubazione con MitoTEMPO induceva un incremento della funzione endoteliale sovrapponibile a SRT1720 nei medesimi gruppi e la preincubazione combinata SRT1720+MitoTEMPO non produceva ulteriori miglioramenti della funzione vascolare suggerendo che l’azione di Sirt-1 si estrinsechi mediante un controllo nella produzione dei mtROS.
La combinazione dei risultati funzionali e molecolari dello studio suggeriscono che Sirt-1 abbia un fondamentale ruolo nella modulazione della disfunzione endoteliale associata all’obesità e all’invecchiamento mediante il controllo dei mtROS dipendente da p66Shc.
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