• clonaggio genico
• comunità microbica solfuro ossidante
• FISH
• isolamento in coltura
• T-RFLP

I batteri solfuro ossidanti (Sulphur Oxidizing Bacteria, SOB) sono microrganismi in grado di ossidare le forme ridotte dello zolfo, come il solfuro di idrogeno (H2S), in forme meno tossiche e più facilmente eliminabili dalle acque contaminate, come lo zolfo elementare. I reflui conciari sono caratterizzati dalla presenza di vari agenti inquinanti e da una concentrazione rilevante di solfuri, per tale motivo i SOB potrebbero avere un ruolo nella purificazione dei reflui di queste aziende. Nonostante siano stati molteplici gli isolamenti di questi microrganismi, le loro potenzialità metaboliche non sono state ancora completamente sfruttate negli impianti di depurazione dei reflui conciari. Il progetto BIOSUR (LIFE11 ENV/IT/075) ha come scopo la messa a punto di un reattore innovativo ed ecosostenibile, capace di rimuovere l’H2S dai reflui conciari gassosi attraverso un processo biologico che si avvale di comunità microbiche solfuro ossidanti. Il lavoro oggetto della mia tesi si inserisce nella fase preliminare dello sviluppo del prototipo. Lo scopo è stato quello di caratterizzare e monitorare una biomassa specializzata selezionata a partire da matrici presenti nell’impianto CUOIODEPUR S.p.a., per valutarne il potenziale solfuro-ossidante.
La biomassa è stata selezionata in un reattore inoculato con fango biologico e fango primario dell'impianto. Le condizioni imposte sono state estremamente selettive: concentrazioni di solfuri pari a 2-4 mg/l e pH compreso tra 2 e 4. La comunità microbica è stata studiata sia attraverso tentativi di isolamento in coltura, sia con l’uso di tecniche molecolari, impiegando come marcatore molecolare il gene che codifica per l’RNA ribosomale 16S (16S rRNA). Con il Terminal-Restriction Fragment Lenght Polymorphism (T-RFLP) sono stati indagati i polimorfismi di sequenza e valutato il numero di Operational Taxonmic Unit (OTU). Con il software PAST sono stati calcolati gli indici di diversità (Simpson e Shannon-Wiener) ed eseguite le analisi di Canonical Corresponce Analysis (CCA), non metric-Mulidimensional Scaling (nm-MDS), oltre al test di statistica inferenziale ANOSIM. Sono state allestite tre librerie geniche per esaminare la comunità microbica sia nella fase di start-up del reattore, sia nella steady state. I batteri sono stati identificati tramite sequenziamento dei cloni rappresentativi. Sulla base dei risultati ottenuti dalle librerie geniche, sono stati eseguiti degli esperimenti di ibridazione fluorescente in situ (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH), per una stima diretta della presenza batterica nei campioni. Per gli isolamenti in coltura è stato messo a punto un terreno a base di tiosolfato arricchito con altri elementi minerali, per ricreare le condizioni idonee alla crescita di batteri chemiolitoautotrofi.
I risultati ottenuti dal T-RFLP mostrano un’evoluzione della comunità microbica dalla fase di start up alla steady state. La nm-MDS mostra una separazione tra le comunità batteriche dei campioni nella fase di start-up e quelle dei campioni della steady state, indicando un cambiamento della comunità microbica tra le due fasi. È stato inoltre valutato l’impatto del pH sulla comunità batterica ed anche in questo caso, per campioni prelevati a valori differenti di pH, si assiste ad una clusterizzazione in gruppi separati. I dati risultano statisticamente significativi, come dimostrato dall’ANOSIM (p<0,01 e p<0,01). La CCA indica che nella fase di start-up la comunità è maggiormente influenzata dall’aggiunta dei solfuri, invece nella steady state da quella dei cloruri e quindi dall’abbassamento del pH. I risultati ottenuti dalle librerie geniche concordano con quelli del T-RFLP: i fanghi dello start-up (FBP407 e FPP106A) presentano un’ampia variabilità microbica rispetto al campione della steady state (NI29M). I 131 cloni digeriti nella library FBP407 sono stati raggruppati in 25 OTU e le due OTU maggiormente presenti appartengono al phylum Firmicutes. Nella library FPP106A sono stati digeriti 145 cloni suddivisi in 29 OTU, con una percentuale maggiore di batteri appartenenti al genere Denitromonas. Nel campione NI29M, i 110 cloni sottoposti a screening sono stati suddivisi in 6 OTUs. Un solo pattern, che rappresenta il 65% dei cloni totali, costituisce la OTU dominante. Tale OTU è stata associata al SOB Halothiobacillus neapolitanus, dimostrando una specializzazione della biomassa verso la componente solfuro ossidante. La prevalenza di H. neapolitanus nel campione NI29M e la sua quasi totale assenza nei fanghi, è stata confermata anche dalla FISH. Dalle prove di isolamento sul campione FPP106A sono stati isolati e caratterizzati batteri eterotrofi e due batteri solfuro ossidanti, lo stesso H. neapolitanus e Ochrobactrum spp.
I dati ottenuti mostrano chiaramente un alto potenziale per la solfuro-ossidazione a carico soprattutto del fango primario dell'impianto.