• albumina umana

Il presente lavoro di tesi si propone di sviluppare una piattaforma per l’analisi computazionale dei siti di legame dell’ Albumina sierica umana (Human Serum Albumin, HSA), in grado di predire il possibile legame di un dato ligando, valutandone l’interazione nei vari siti di legame presenti nella HSA. Tale analisi, condotta in modo semi automatico, mira a determinare il sito di legame più probabile per la molecola in esame.
L’ HSA è una proteina presente in grande concentrazione nel plasma, infatti rappresenta circa il 50% delle proteine totali del siero. È costituita da 585 aminoacidi, organizzati in una struttura terziaria plastica grazie alla presenza di 17 ponti disolfuro. Questa plasticità consente di svolgere una serie di funzioni tra cui il mantenimento della pressione oncotica del plasma, la regolazione del tono vascolare attraverso il trasporto ed il rilascio di monossido di azoto (NO), il trasporto di metalli pesanti e di ioni, il sequestro di radicali liberi dell’ossigeno e l’inattivazione di metaboliti lipofili tossici (come la bilirubina).
Dal punto di vista procedurale, l’elaborato di tesi si focalizza sulla fase preliminare della creazione della piattaforma, ovvero l’identificazione e l’analisi di tutti i siti di legame, quindi la preparazione dei dati per studi futuri.
Sono stati selezionati i cristalli di HSA dal database UniProt, caratterizzati dal codice P02768, utilizzato per identificare in modo univoco la specifica proteina.
Le strutture sono state preparate mantenendo solo la catena principale ed i ligandi, mentre i cristalli senza ligandi sono stati esclusi dalle analisi successive. Tali strutture sono state allineate tramite il tool match maker del software Chimera, dopodiché si è reso opportuno verificare che le proteine mantenessero gli stessi residui amminoacidici e la corrispettiva numerazione, quindi sono state suddivise in gruppi, in base ai siti di legame e sono state nuovamente allineate, prendendo come riferimento il ligando più grande per ogni sito. Successivamente, è stata eseguita un’analisi che ha permesso di ottenere, nel range di interesse, liste di residui amminoacidici per ogni sito di legame.
Partendo da questo elenco e utilizzando, in questo caso, il software Maestro, sono state eseguite operazioni di controllo e correzione dei residui, talvolta tagliati e/o sdoppiati.
Oltre ad esserci stato un riscontro manuale e grafico, è stato creato uno script per automatizzare il processo di verifica. Infine, le proteine sono state salvate in formato mol2, riallineate e si è proceduto con il calcolo delle matrici, per ogni sito di legame.
Le matrici di allineamento sono state inizialmente create con il software Mustang, ma sono state successivamente scartate a favore dell’ rms_analysis di Gold, a causa delle limitazioni di Mustang. Quest’ultime sono state impiegate per identificare i cluster di strutture caratterizzate da siti di legame con geometrie simili e per ognuno di essi sono stati selezionati specifici cristalli, da utilizzare per il docking.
Come ultima fase di questo lavoro di tesi, interlocutoria e preparativa degli step successivi, è stata analizzata l’ HSA complessata con diversi ligandi (Warfarin e Diazepam), utilizzando tecniche di cross-docking e self-docking, che hanno fornito una base per la selezione dei programmi di docking più adatti agli studi futuri di interazione proteina-ligando.