• algoritmi di analisi dati
• Microscopia TIRF a più colori
• ottimizzazione setup
• ricostruzione di tracce di singole particelle

The work reported in this thesis was carried out at the NEST laboratory of Scuola Normale Superiore (Pisa); the research line concerns dynamics and stoichiometry of neurotrophin receptors and their complexes on the membrane of living cells, analysed by single particle tracking (SPT) methods. The objective of the thesis was the generalization of the available tools, which allowed the realization of single-channel SPT experiments, towards the realization of more sophisticated two-colour SPT experiments. The first application of the technique shall be the analysis of the interaction of different molecules, like receptors and their ligands or different (co)receptors (e.g. TrkA, p75).
First, I worked on the experimental setup: a TIRF microscopy system has been adapted and optimized for the new type of experiments. Then I worked on the improvement of photostability of fluorescent probes dealing with the problem of photobleaching.
Moreover, I developed a method to overlap the two detection channels with accuracy of about 10 nm and I wrote MatLab codes to integrate the software “u-track” for the reconstruction of the tracks of two interacting molecules.
The new system was applied to TrkA neurotrophic receptors labelled with two different fluorophores; I reconstructed the tracks of single and paired receptors on the membrane of living neuroblastoma cells, and obtained an estimation of its dissociation constant.

Le ricerche svolte per questa tesi sono state fatte presso il laboratorio NEST della Scuola Normale Superiore (Pisa); la linea di ricerca in cui sono inserite riguarda lo studio della dinamica e della stechiometria di recettori neurotrofinici e dei loro complessi sulla membrana di cellule vive, analizzate mediante metodi di ricostruzione di traiettorie di singole particelle (single particle tracking - SPT). L’obiettivo della tesi è stato quello di generalizzare gli strumenti disponibili, che permettevano la realizzazione di esperimenti di SPT a singolo colore, per la realizzazione di più complessi esperimenti di SPT a due colori. La prima applicazione di queste tecniche riguarderà lo studio delle interazioni di molecole diverse, come recettori e loro ligandi o differenti (co)recettori (ad esempio TrkA e p75) sulla membrana basale di cellule in coltura.
Inizialmente ho lavorato sull’apparato sperimentale: un sistema di microscopia TIRF è stato adattato e ottimizzato per il nuovo tipo di esperimenti. Ho poi lavorato sul miglioramento della fotostabilità delle sonde fluorescenti affrontando il problema del photobeaching.
Inoltre, ho sviluppato un metodo per sovrapporre i due canali di rivelazione con un’accuratezza di circa 10 nm e ho scritto dei codici MatLab per integrare il software “u-track” e poter ricostruire le traiettorie di due molecole interagenti.
Il nuovo sistema è stato applicato a recettori neurotrofinici TrkA marcati con due diversi fluorofori; ho ricostruito le traiettorie dei singoli recettori e di recettori dimerici sulla membrana di cellule vive di neuroblastoma, ottenendo una stima della loro costante di dissociazione.