• MMP-9
• nanoparticelle
• nicchie sintetiche
• scaffold

L’ingegnerizzazione del tessuto cardiaco costituisce attualmente la principale sfida dell’ingegneria tissutale nel settore cardiovascolare. In particolare essa è finalizzata all'ottenimento di sostituti di tessuti o organi nativi, con biofunzionalità e bioattività tali da renderli in grado di promuovere la crescita e la differenziazione delle cellule.
I tessuti e gli organi ingegnerizzati possono essere ottenuti utilizzando, come materie prime di partenza, materiali polimerici naturali, sintetici o bioartificiali. Questi ultimi rappresentano la scelta migliore in quanto permettono di coniugare i benefici dei materiali sintetici e di quelli biologici, ottenendo una nuova classe di materiali con aumentata biocompatibilità e migliori prestazioni.
Inoltre una corretta preparazione del materiale, non solamente in termini di proprietà chimico-fisiche ma anche morfologiche, permette di ottenere scaffold in grado di svolgere innanzitutto una funzione di supporto per le cellule e in seguito anche di favorirne il differenziamento.
Lo scaffold ideale, inoltre, dovrebbe essere biodegradato e bioriassorbito dopo aver svolto la sua funzione, in modo tale da poter essere gradualmente sostituito dal tessuto rigenerato.
L’attività svolta nel seguente lavoro di tesi ha avuto come obiettivo la messa a punto di scaffold bioartificiali multifunzionali in grado di fornire un supporto alla crescita delle cellule del miocardio e svolgere un ruolo attivo nel prevenire le disfunzioni dovute all'infarto del miocardio: più precisamente lo scopo maggiore era quello di realizzare un nuovo scaffold biodegradabile e tridimensionale a replica della matrice extracellulare cardiaca e che fosse funzionalizzato mediante un'innovativa nanotecnologia per prevenire il rimodellamento del ventricolo sinistro.
Sono stati, dunque, sintetizzati nuovi materiali polimerici per l'ottenimento degli scaffold a replica della matrice extracellulare cardiaca ma anche per la preparazione di opportune piattaforme nanoparticellari da utilizzare per la biofunzionalizzazione degli scaffold.
Il punto di partenza è stato la sintesi di un nuovo copolimero a tre blocchi di tipo poli(estere-etere-estere), poli(valerolattone)-poli(etilen ossido)-poli(valerolattone) (PVL-POE-PVL).
Il copolimero è stato sintetizzato in un primo momento utilizzando un catalizzatore metallico, in un secondo momento mediante un apparato sperimentale ed innovativo che permette di ottenere il materiale in assenza di catalizzatori, facendo avvenire la reazione ad alto vuoto ed elevata temperatura, mediante l'utilizzo di un particolare sistema progettato e realizzato proprio per la sintesi di questo tipo di copolimero.
Dopo aver ottenuto il materiale polimerico di nuova sintesi, esso è stato miscelato con un polimero naturale (gelatina) per l'ottenimento del materiale bioartificiale.
Come secondo passo, lo studio ha riguardato la realizzazione di matrici microfabbricate dei materiali sintetici e bioartificiali selezionati, che riproducessero la sede anatomica cardiaca da rigenerare: questo è stato possibile preparando i costrutti direttamente su stampi in poli(dimetilsilossano), ottenuti tramite soft lithography e aventi una geometria planare predefinita, che replicasse al meglio la struttura della matrice extracellulare cardiaca.
Tali microfabbricati sono stati caratterizzati dal punto di vista morfologico (SEM), chimico-fisico (IR, DSC, GPC) e funzionale (DMA, test di degradazione, test di stabilità a sterilizzazione, test biologici), in modo da valutarne le proprietà fondamentali quali composizione chimica, peso molecolare, omogeneità chimica, porosità, modulo elastico, cinetica di degradazione, citocompatibilità e biofunzionalità.
Per quanto riguarda la caratterizzazione morfologica, l'analisi al microscopio elettronico (SEM), ha permesso di osservare una struttura più densa in sezione e più porosa in superficie; gli scaffold riproducono con soddisfacente risoluzione la geometria della matrice extracellulare cardiaca, presentando cavità rettangolari profonde circa la metà dello spessore complessivo possono essere considerate un buon risultato.
Inoltre, per i materiali bioartificiali si evidenzia la presenza di inclusioni di gelatina abbastanza sferiche di diametro medio compreso tra 10 e 20 μm; vi è quindi la possibilità che queste diano origine alla formazione di pori in seguito al rilascio del componente naturale.
La porosità e l’interconnessione fra i pori sono parametri importanti per uno scaffold in quanto consentono sia il trasporto dei nutrienti e l’eliminazione dei cataboliti, sia la crescita delle cellule, quindi dei tessuti, che potranno proliferare fino alla completa ricostruzione del tessuto. Inoltre, la porosità rappresenta un fattore importante nella determinazione della risposta cellulare poiché non solamente controlla la crescita del tessuto ma ne influenza anche la differenziazione.
Per quanto riguarda la caratterizzazione chimico-fisica, la spettroscopia IR ha permesso di verificare la presenza di tutte le bande identificative del copolimero sia nello spettro del materiale ottenuto tramite sintesi con catalizzatore sia in quello ottenuto con sintesi tramite sistema ad alto vuoto, a conferma della natura estere-etere-estere dei materiali ottenuti.
L’analisi al DSC ha permesso di indagare il comportamento termico dei vari campioni e quindi di determinarne le transizioni termiche caratteristiche: si evidenzia la presenza di un importante evento endotermico, con un massimo in corrispondenza di diverse temperature a seconda dei campioni analizzati, relativo alla fusione delle zone cristalline del copolimero.
Per quanto riguarda l'analisi dinamico-meccanica, sono state effettuate prove meccaniche utilizzando l’analizzatore DMA 8000. Le prove di tensione a frequenza multipla hanno permesso di constatare che i moduli di immagazzinamento e di perdita non mostrano particolari variazioni al variare delle frequenze di applicazione del carico considerate (1, 2 e 3 Hz). Inoltre si è potuto notare che i sistemi (soprattutto il copolimero ottenuto a partire dal PEG 35000) presentano valori del modulo elastico dell'ordine del MPa e pertanto idonei ai fini dell'applicazione a cui essi sono destinati, in quanto si mantengono in un range di valori abbastanza vicini a quelli del miocardio umano.
Per quanto riguarda, invece, i materiali bioartificiali, i moduli elastici risultano essere maggiori, pur mantenendosi nel range di valori accettabili per le finalità che ci siamo proposti.
I test di degradazione hanno previsto una serie di valutazioni eseguite sui campioni degradati. E' stata innanzitutto valutata la perdita in peso gravimetrica dei campioni, inoltre, i campioni sono stati analizzati al microscopio elettronico per verificare lo stato di degradazione dopo 6 e 50 giorni.
Si è osservata una graduale diminuzione del peso dei campioni con un andamento decrescente abbastanza simile per i sistemi microfabbricati ottenuti a partire dai copolimeri realizzati tramite sintesi con catalizzatore; quelli realizzati tramite sintesi ad alto vuoto presentano, invece, una cinetica di degradazione più rapida, infatti dopo 50 giorni di degradazione il loro peso residuo indica una perdita di circa il 30% rispetto al valore iniziale. Le immagini ottenute al SEM hanno confermato questa tendenza; in particolare osservando le immagini a 6 giorni non si sono riscontrate particolari differenze rispetto allo stato non degradato, mentre per quanto riguarda le immagini a 50 giorni la differenza è apparsa molto evidente, presentando svariati punti in cui si è evidenziata una perdita di frammenti e un'aumentata porosità.
Infine, la degradazione è stata studiata mediante cromatografia a permeazione di gel, calcolando la diminuzione del peso molecolare del componente sintetico, allo scopo di valutare la cinetica di degradazione dei sistemi polimerici: si è riscontrato un andamento decrescente del valore Mw all’aumentare del tempo di degradazione indipendentemente dal tipo di campione in esame. Da queste analisi si è evidenziat6 come il materiale sintetizzato in assenza di catalizzatore con PEG 35000 subisca una degradazione a livello della catena macromolecolare più ridotta rispetto agli altri copolimeri.
Il test di stabilità a sterilizzazione ha mostrato come tutti i campioni analizzati siano in grado di mantenere la forma: non sono state riscontrate, infatti, perdite in peso significative ma tutti i valori calcolati sono inferiori al 10%.
In particolare, nell'ambito di tale lavoro di tesi, è stata posta attenzione al ruolo che può ricoprire la morfologia dello scaffold nel favorire la vitalità cellulare in seguito alla semina. Pertanto, sono stati comparati i risultati dei test biologici svolti su scaffold microstrutturati a replica della matrice extracellulare cardiaca con quelli ottenuti dai test in scaffold non microstrutturati.
I test biologici hanno permesso di dimostrare che sia la presenza della gelatina sia la struttura anisotropica hanno un'influenza estremamente positiva per quanto riguarda adesione e vitalità cellulare; in particolare, combinando i benefici di entrambe si ottengono scaffold in cui si riscontra il più alto tasso di vitalità cellulare (88% rispetto ai pozzetti di controllo dopo 3 giorni).
Infine, sono state preparate nanoparticelle polimeriche a impronta molecolare in grado di riconoscere e legare l'enzima metalloproteinasi (MMP-9). È stato dimostrato da studi recenti che questi enzimi sono responsabili del rimodellamento ventricolare post-infarto, mentre i corrispondenti inibitori tessutali (TIMP) possono prevenire lo scompenso cardiaco. E' noto che l'inibizione o la distruzione delle MMP potrebbe ridurre la disfunzione cardiaca, ed in particolare la specificità dell'inibizione è l'obiettivo fondamentale da raggiungere per non compromettere fenomeni fondamentali quali la angiogenesi ed il reclutamento di cellule staminali nel sito infartuato.
Pertanto, al fine prevenire il rimodellamento del ventricolo sinistro e le disfunzioni dovute all'infarto del miocardio, sulla superficie dei sistemi microfabbricati precedentemente realizzati sono state deposte le nanoparticelle imprintate verso le MMP-9, per modulare la bio-disponibilità di questi enzimi rispetto ai loro inibitori e regolare quindi l'equilibrio MMP/TIMP nella zona infartuata.
La capacità, da parte delle nanoparticelle ad impronta molecolare, di rilegare le MMP-9 è stata valutata mediante test quantitativi di rilegame, condotti mediante analisi cromatografica, e l'attività enzimatica, valutata mediante zimografia.
I test di estrazione e rilegame hanno mostrato che le particelle ad impronta molecolare sono in grado di rilegare una quantità di enzimi maggiore rispetto a particelle non ad impronta molecolare e di natura chimica analoga, confermando che le particelle ottenute mediante la tecnologia ad impronta molecolare è possibile realizzare nanoparticelle dotate di siti di riconoscimento specifici e selettivi nei confronti delle MMP-9.
Si è, inoltre, visto che la capacità di rilegame coincide perfettamente con la percentuale di estrazione, dato di notevole significatività perchè dimostra che tutte le cavità libere createsi dopo l'estrazione sono state completamente occupate dagli enzimi rilegati.
L'analisi zimografica ha permesso di evidenziare l’attività delle MMP-9 relative rispettivamente alla soluzione di rilegame delle particelle non imprintate e alla soluzione di rilegame delle particelle imprintate, ottenendo un valore più alto per queste ultime.
Lo scopo iniziale era quello di ottenere uno scaffold bioartificiale e biodegradabile, che fosse citocompatibile e in grado di favorire l'adesione e la proliferazione cellulare, in grado di svolgere una funzione attiva grazie alla duplice funzionalità, morfologica ma anche grazie alla presenza delle nanoparticelle ad impronta molecolare, per promuovere il differenziamento cellulare ed inibire il rimodellamento del ventricolo sinistro.
In conclusione, si può affermare che il sistema prodotto sembra essere un valido candidato per l’ingegnerizzazione del tessuto miocardico e la prevenzione del rimodellamento ventricolare, dal momento che ha mostrato ottime caratteristiche di processabilità, buone proprietà meccaniche, di stabilità a sterilizzazione e di citocompatibilità.
Inoltre, si può concludere che la funzionalizzazione mediante nanoparticelle ad impronta molecolare è un sistema efficace per la rimozione delle MMP-9, dando la possibilità di ottenere uno scaffold in grado di regolare l'equilibrio MMP/TIMP nella zona infartuata e prevenire le disfunzioni cardiache.
Gli sviluppi futuri del presente lavoro riguardano l'ottimizzazione del sistema ottenuto:
valutazione della morfologia sulla differenziazione delle cellule nel senso cardiaco (utilizzando colture in vitro), valutazione della selettività delle nanoparticelle ad impronta molecolare nei confronti delle TIMPs e degli altri tipi di MMPs, preparazione di scaffold tridimensionali multi-strato e coltura cellulare dinamica (bioreattore) per l'ingegnerizzazione del tessuto miocardico in vitro, preparazione di scaffold tridimensionali multi-strato biofunzionalizzati con fattori di reclutamento per l'ingegnerizzazione del tessuto miocardico in vivo, esperimenti in vivo per valutare l'efficacia dei sistemi multi-funzionali con effetto sinergico sia nel prevenire disfunzioni cardiache sia nello stimolare la formazione di nuovo tessuto.