• anti-EGFR
• biopsia liquida
• ras-braf
• ritrattamento
• liquid biopsy
• ras-braf
• anti-EGFR
• metastatic colorectal cancer
• retreatment
• tumore colorettale metastatico

Il tumore del colon-retto è la terza neoplasia maligna per frequenza e la quarta causa di morte per cancro nel mondo. Le probabilità di guarigione sono elevate se il tumore è precocemente diagnosticato. Al contrario, se in stadio metastatico, le prospettive di cura sono più limitate, nonostante i notevoli progressi fatti in questi ultimi anni nella caratterizzazione molecolare del carcinoma colo-rettale e lo sviluppo di farmaci biologici mirati che possono essere combinati alla chemioterapia.

Fra questi farmaci, gli anticorpi diretti contro il recettore del fattore di crescita epidermico (anti-EGFR) sono un’arma terapeutica ormai consolidata nel trattamento del tumore del colon-retto metastatico, ma non tutti i pazienti con questa patologia ne traggono beneficio. Infatti, gli anti-EGFR esercitano un effetto citostatico sulla cellula maligna solo nel caso in cui la via di segnalazione a valle del recettore sia intatta relativamente ai geni RAS e BRAF. Diversamente, se tali sequenze sono mutate, le proteine poi tradotte inducono una crescita incontrollata del tumore, che si svincola completamente dal recettore EGFR, vanificando la somministrazione dei farmaci target contro di esso diretti. Pertanto, nella pratica clinica, prima di intraprendere una terapia in un paziente mai esposto a trattamenti oncologici, la caratterizzazione molecolare di questi geni su tessuto tumorale è imprescindibile per personalizzare il trattamento e garantire al paziente il miglior trattamento possibile, che nei pazienti RAS/BRAF wild-type e con tumore primitivo colico sinistro è rappresentato dalla combinazione di chemioterapia e anti-EGFR.

Dopo un’iniziale beneficio, purtroppo la maggior parte dei pazienti sviluppa più o meno precocemente una resistenza agli anti-EGFR, per effetto della selezione di cloni resistenti RAS/BRAF mutati dovuta alla pressione evolutiva esercitata dal farmaco, che eliminando dei competitor sensibili al trattamento, determina la contestuale espansione di cloni refrattari alla terapia, non rilevati alla diagnosi con le metodiche di sequenziamento routinariamente utilizzate nella pratica clinica, in quanto non sufficientemente sensibili.

Il tumore è tuttavia una malattia dinamica, che evolve nel tempo. Alla sospensione del farmaco anti-EGFR, il microambiente tumorale può essere nuovamente favorevole all’espansione delle cellule RAS/BRAF wild-type, anti-EGFR sensibili, le quali prendendo il sopravvento sulle resistenti, ora sotto la pressione selettiva di una diversa linea di terapia, potrebbero nuovamente rispondere ad un farmaco anti-EGFR, che aveva perso apparentemente efficacia.

Questo approccio innovativo, di cui è stato pioniere il Polo Oncologico dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa, prende il nome di ritrattamento, ed è supportato dai risultati positivi di uno studio proof-of-concept di fase II a singolo braccio (CRICKET), che nel 2019 ha dimostrato un tasso di risposta del 21% in pazienti pesantemente pre-trattati e chemo-refrattari che ricevevano nuovamente un anti-EGFR dopo aver sviluppato contro di questo resistenza nel corso della prima linea. Le risposte documentate erano inoltre osservate soltanto nei pazienti che prima di ricevere nuovamente il ritrattamento erano wild-type per i geni RAS/BRAF ricercati nel DNA tumorale circolante (ctDNA) con la biopsia liquida, una metodica innovativa che permette di caratterizzare il paziente da un punto di vista molecolare con un semplice prelievo di sangue, risparmiando l’invasività di una biopsia su tessuto, difficilmente proponibile in pazienti già pesantemente pre-trattati, frequentemente in precarie condizioni cliniche. Inoltre, per la stessa natura del materiale genetico sequenziato, che viene ricercato direttamente nel torrente ematico, la biopsia liquida ha il notevole vantaggio rispetto alla biopsia tissutale di essere maggiormente rappresentativa della biologia tumorale nel suo complesso, rispetto a quando non sarebbe un prelievo di tessuto da una singola sede di malattia, tenendo presente che generalmente i pazienti metastatici recano plurime sedi in cui la malattia è disseminata.

I risultati promettenti sulla selezione molecolare dei pazienti RAS/BRAF wild-type alla biopsia su tessuto in previsione di un ritrattamento con anti-EGFR ha portato altri gruppi ricerca a percorrere la stessa strada a livello globale, con ulteriori conferme ottenute dagli studi E-Rechallenge e CHRONOS.

Inoltre, la biopsia liquida è entrata nella routine dei pazienti pre-trattati RAS/BRAF wild-type con carcinoma del colon-retto metastatico seguiti presso il Polo Oncologico dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa, dei quali abbiamo raccolto retrospettivamente i dati molecolari e di outcome all’interno della più grande coorte real-life nota di pazienti pretrattati sottoposta a un trattamento guidato dalla selezione molecolare basata sul ctDNA con digital droplet PCR (ddPCR).

Al fine di caratterizzare ulteriormente la biologia dei pazienti RAS/BRAF wild-type alla biopsia liquida, che possono comunque presentare meccanismi ulteriori di resistenza agli anti-EGFR, abbiamo analizzato dei campioni di plasma prelevati prima del ritrattamento con un pannello di Next Generation Sequencing (OncomineTM), in grado di individuare potenziali mutazioni di resistenza in 14 geni sequenziali in parallelo.

La stessa analisi NGS è stata replicata in una coorte prospettica di 101 pazienti reclutati nel trial multicentrico di fase II randomizzato, coordinato dal Polo Oncologico di questa Azienda, e attualmente in corso presso le Oncologie di tutto il Paese.

Nella coorte retrospettiva, 31 pazienti RAS/BRAF wild-type alla biopsia tissutale e già sottoposti con beneficio ad un anti-EGFR sono stati sottoposti a biopsia liquida con ddPCR dopo essere progrediti a tale farmaco. Fra questi, 8 (26%) sono stati riclassificati come RAS mutati e, fatta eccezione per un paziente, nessuno è stato ritrattato con anti-EGFR, mentre 23 (74%) hanno mantenuto il profilo molecolare RAS/BRAF wild-type e sono stati ritrattati con un anti-EGFR.

Fra i pazienti radiologicamente valutabili, i pazienti RAS/BRAF wild-type sono stati gli unici a presentare risposte obiettive (16%). Nessuna risposta è stata invece documentati nei RAS/BRAF mutati. Inoltre, i pazienti RAS/BRAF wild-type hanno mostrato una sopravvivenza mediana libera da progressione (mPFS) e una sopravvivenza mediana globale (mOS) superiore rispetto alla controparte RAS/BRAF mutata [mPFS: 5.8 mesi versus 3.0 mesi (HR: 0.53, 95% CI: 0.20 - 1.41), p=0.10 e mOS: 15.0 mesi versus 6.8 mesi (HR: 0.28, 98% CI: 0.08-0.93), p=0.0016].

Dei 23 pazienti RAS/BRAF wild-type secondo ddPCR, in 18 è stato possibile effettuare un’ulteriore caratterizzazione molecolare con NGS su ctDNA e nel 78% dei casi è stata trovata almeno una mutazione genica del pannello OncomineTM, inclusi due casi di mutazioni a carico del gene KRAS non individuate con la ddPCR.

Nella popolazione prospettica sottoposta a screening molecolare (n=101) con biopsia liquida seguendo lo stesso approccio NGS, il ctDNA è stato sequenziato con successo in 90 pazienti e in 25 di questi (28%) è stata riportata una mutazione RAS/BRAF V600E. Fra i rimanenti 65 (72%), 49 pazienti (75%) presentavano una mutazione a carico di almeno un gene del pannello. In particolare, sono state individuate potenziali alterazioni di resistenza agli anti-EGFR a carico dei geni PIK3CA, EGFR e AKT nel 11%, 1% e 1% dei pazienti. Non è stata evidenziata una differenza statisticamente significativa relativamente all’intervallo di tempo trascorso fra l’ultima somministrazione di anti-EGFR e la biopsia liquida nelle coorti RAS/BRAF wild-type e RAS/BRAF mutata (13.8 versus 16.9 mesi, p=0.70).