• Nrp-1
• retina
• RNA binding proteins
• Xenopus laevis
• XLin-28

Nel corso dello sviluppo embrionale la formazione di tessuti neurali avviene a partire da progenitori multipotenti e richiede una regolazione integrata della loro proliferazione, dell'uscita dal ciclo cellulare e dell'attivazione di fattori necessari al differenziamento

La retina di X. laevis e' un sistema ideale per lo studio di questi processi, poiche' e' costituita da cinque tipi di neuroni (fotorecettori, cellule gangliari, orizzontali, amacrine e bipolari) e un tipo di cellula gliale (glia di Müller), facilmente riconoscibili per morfologia e localizzazione negli strati retinici.
I diversi tipi cellulari retinici sono generati in una sequenza temporale ben definita ed evolutivamente conservata. Il destino cellulare viene stabilito dall’attivazione di geni specifici, tra i quali geni homeobox come Xotx5b (fotorecettori), Xotx2 e Xvsx1 (bipolari). Come atteso, l’attivazione di questi geni avviene secondo la stessa successione temporale con la quale i corrispettivi tipi cellulari sono generati. E' stato recentemente dimostrato che l'attivazione di questi geni homeobox e' regolata a livello traduzionale, ovvero gli mRNA sono espressi in tutti i progenitori precoci ma le proteine corrispondenti sono tradotte solo nelle cellule destinate a differenziare in bipolari o fotorecettori (Decembrini et al., PloS Biol. 2006). Questo controllo traduzionale e' esercitato da fattori tuttora ignoti in grado di riconoscere segnali in cis nella regione non tradotta in 3' (3'UTR) degli mRNA. E' inoltre ancora sconosciuto se meccanismi di regolazione traduzionale simili agiscano anche a livello di altri geni chiave per la retinogenesi.

Da quanto noto in letteratura i principali fattori in grado di regolare la traduzione legando il 3'UTR possono essere microRNA (miRNA) e proteine che legano l'RNA (RBP). Nel mio lavoro di tesi ho studiato alcune RBP candidate per analizzarne il ruolo nella retinogenesi e per verificare se potessero regolare la traduzione dei geni chiave per la specificazione del destino cellulare.

In primo luogo, ho determinato il pattern di espressione di mRNA codificanti per RBP candidate sia nell'embione intero (ibridazioni in situ whole-mount) sia con risoluzione cellulare nella retina a diversi stadi di sviluppo (ibridazioni in situ su sezione). Scopo di questa analisi e' stato identificare RBP espresse in progenitori cellulari retinici non ancora usciti dal ciclo cellulare, e quindi soggetti a regolazione traduzionale di geni chiave del destino differenziativo. Da questa analisi sono emerse due proteine piu' interessanti, Xlin-28A e Nrp-1, che ho ulteriormente caratterizzato con esperimenti di tipo funzionale.
Per verificare se queste proteine sono coinvolte nel differenziamento, ho condotto saggi di guadagno di funzione. Ho innanzitutto generato i costrutti plasmidici per l'espressione di queste proteine, e ho lipofettato i costrutti nelle vescicole ottiche a stadio embrionale 17 (st.17). Successivamente ho caratterizzato i diversi tipi cellulari generati nelle retine lipofettate in embrioni a st. 42 (stadio di retina matura), utilizzando criteri morfologici o marcatori dei tipi cellulari retinici.
Da questi esperimenti e' emerso che Xlin-28A e Nrp-1 alterano in modo diverso le proporzioni dei neuroni retinici. La sovraespressione di Xlin-28A causa un aumento della proporzione di cellule amacrine a discapito dei tipi cellulari piu' tardivi. La sovraespressione di Nrp-1 invece causa la diminuzione della proporzione di fotorecettori e l'aumento della proporzione di cellule gliali.
Per capire se queste alterazioni fossero dovute ad effetti delle proteine studiate sulla proliferazione cellulare, ho condotto esperimenti di birthdating (determinazione del momento di uscita dal ciclo cellulare) di progenitori retinici lipofettati, utilizzando iniezioni di Bromodeossiuridina (BrdU) a diversi stadi della retinogenesi.
Questi esperimenti mostrano che Xlin-28A non ha effetti sulla proliferazione cellulare, ma causa la generazione di cellule amacrine tardive, producendo un fenotipo eterocronico. Nrp-1 invece induce il differenziamento precoce di tutti i neuroni retinici.
I risultati ottenuti suggeriscono che queste due RBPs hanno ruoli differenti nell'istogenesi retinica. Nrp-1 non e' probabilmente coinvolto nella regolazione della traduzione dei geni chiave per la specificazione dei diversi neuroni retinici. Xlin-28A invece altera il timing della retinogenesi e potrebbe agire sui geni responsabili del destino cellulare. Ulteriori esperimenti sono necessari per capire quali siano gli mRNA regolati da queste proteine e caratterizzarne piu' dettagliatamente la funzione nel controllo dell'istogenesi retinica.