• DNA barcoding
• freshwater ecosystems
• freshwater macroinvertebrates
• local dataset
• morphological identification
• Serchio river

Gli ecosistemi d’acqua dolce rappresentano una delle componenti più vulnerabili della biosfera, in quanto esposti a crescenti minacce derivanti dai cambiamenti climatici e dall’impatto antropico, come riportato dall’Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) del 2022. I macroinvertebrati d'acqua dolce rivestono un ruolo cruciale in tali ecosistemi, svolgendo funzioni fondamentali come la ciclizzazione dei nutrienti. Sono inoltre ampiamente utilizzati a livello globale come indicatori biologici e nel calcolo di indici per valutare la salute degli ecosistemi acquatici. Negli ultimi anni, le strategie di monitoraggio della biodiversità integrano tecniche di analisi molecolare, al fine di massimizzare la caratterizzazione degli organismi presi in esame, garantendo una risoluzione tassonomica più alta, riducendone i costi e gli sforzi necessari. Il presente studio ha confrontato tecniche standard basate sulla raccolta di macroinvertebrati tramite kick-netting e analisi morfologiche con le moderne tecniche molecolari come il DNA barcoding, con l’obiettivo di creare un database molecolare e fotografico locale. Il Serchio è il terzo fiume per estensione in Toscana, con un ruolo di grande importanza nell’ambito dell’energia e dell’industria locale. Questo rende il relativo bacino idrografico un’area di studio di particolare interesse per il progetto finanziato dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Lucca, al quale fa riferimento il presente studio. Il progetto, intitolato “Quello che l’occhio non vede ma il DNA ambientale sì!”, analizza la biodiversità del bacino tramite metodi tradizionali ed all’analisi dell’environmental DNA tramite metabarcoding. Durante il periodo aprile 2022 - febbraio 2024 sono stati individuati 14 siti di monitoraggio in alcuni dei suoi affluenti, le cui caratteristiche ambientali eterogenee sono rappresentative del bacino. Dopo una valutazione sul campo delle condizioni dei corsi d’acqua, sono stati effettuati campionamenti di macroinvertebrati tramite kick-netting. I 200 campioni totali rinvenuti sono stati successivamente fotografati in alta risoluzione con stereomicroscopio per il riconoscimento morfologico. Successivamente, è stato estratto il DNA dalla maggior parte degli esemplari campionati ed è stata ottenuta una sequenza barcode di un frammento della subunità 1 della citocromo ossidasi (COI) per 78 campioni tramite protocolli di DNA barcoding. Le sequenze e le coordinate e le foto dei campioni analizzati sono state inserite nel dataset S.B.A.M. (Serchio Basin Atlas of Freshwater Macroinvertebrates) all'interno del database BOLD System. Questi dati hanno portato all’assegnazione automatica di 57 BIN (Barcode Index Number), di cui 15 nuovi BIN unici non ancora presenti in banca dati. In seguito, tali sequenze sono state utilizzate per analizzare il contributo del dataset locale all’algoritmo di riconoscimento e assegnazione tassonomica per analisi metabarcoding dell’eDNA svolte nel progetto principale. Il confronto ha permesso di ottenere un aumento nel numero totale di associazioni per la Classe Insecta (da 91 a 166 ASVs), migliorandone inoltre la risoluzione tassonomica (con 126 ASVs su 166 attribuite a dati S.B.A.M.). Questi risultati dimostrano il significativo contributo di studi e progetti locali al miglioramento dei monitoraggi della biodiversità con tecniche molecolari e la necessità di mantenere aggiornati e curati i database globali di riferimento.

Freshwater ecosystems represent one of the most vulnerable components of the biosphere, as they are exposed to increasing threats from climate change and human impact, as reported by the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) in 2022. Freshwater macroinvertebrates play a crucial role in these ecosystems by performing fundamental functions such as nutrient cycling. They are also widely used globally as biological indicators and in the calculation of indices to assess the health of aquatic ecosystems. In recent years, biodiversity monitoring strategies have integrated molecular analysis techniques to maximize the characterization of the organisms under study, ensuring higher taxonomic resolution while reducing costs and efforts required. This study compared standard techniques based on the collection of macroinvertebrates through kick-netting and morphological analyses with modern molecular techniques such as DNA barcoding, with the aim of creating a local molecular and photographic database. The river Serchio is the third largest in Tuscany, playing a significant role in local energy and industry. This makes its basin an area of particular interest for the project funded by the Fondazione Cassa di Risparmio di Lucca, to which this study refers. The project, entitled "Quello che l’occhio non vede ma il DNA ambientale sì!", analyzes the biodiversity of the basin using traditional methods and the analysis of environmental DNA through metabarcoding. During the period from April 2022 to February 2024, 14 monitoring sites were identified in some of its tributaries, whose heterogeneous environmental characteristics are representative of the basin. After a field assessment of the stream conditions, macroinvertebrate samples were collected using kick-netting. The 200 total samples found were subsequently photographed in high resolution with a stereomicroscope for morphological identification. Then, DNA was extracted from most of the sampled specimens, and a barcode sequence of a fragment of the cytochrome oxidase subunit 1 (COI) was obtained for 78 samples using DNA barcoding protocols. Sequences, coordinates and pictures of the analyzed samples were entered into the S.B.A.M. (Serchio Basin Atlas of Freshwater Macroinvertebrates) dataset within the BOLD System database. These data led to the automatic assignment of 57 BINs (Barcode Index Numbers), of which 15 are new unique BINs not present in the database. These sequences were then used to analyze the contribution of the local dataset to the recognition and taxonomic assignment algorithm for eDNA metabarcoding analyses carried out in the main project. The comparison resulted in an increase in the total number of associations for the Class Insecta (from 91 to 166 ASVs), also improving the taxonomic resolution (with 126 ASVs out of 166 attributed to S.B.A.M. data). These results demonstrate the significant contribution of local studies and projects to the improvement of biodiversity monitoring with molecular techniques and the necessity of keeping global reference databases updated and well-maintained.