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Tesi etd-05262014-103714


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
DINI, GIULIA
URN
etd-05262014-103714
Title
Sviluppo e validazione di una nuova metodica per la contemporanea determinazione di buprenorfina e norbuprenorfina su campioni ematici mediante derivatizzazione in fase acquosa.
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott. Calderone, Vincenzo
relatore Dott.ssa Testai, Lara
relatore Dott. Chericoni, Silvio
Parole chiave
  • buprenorfina
  • norbuprenorfina
  • propilcloroformiato
  • buprenorphine
  • norbuprenorphine
  • propyl chloroformate
Data inizio appello
11/06/2014;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
<br>BUPRENORFINA<br>La buprenorfina è una molecola di sintesi derivata dalla tebaina, molecola estratta dall’oppio.Viene utilizzata come analgesico e in terapia sostitutiva della dipendenza da oppiacei, all’interno di un trattamento medico, sociale e psicologico. Si differenzia dagli altri oppiacei per la presenza di un’azione agonista parziale sui recettori µ e antagonista sui recettori δ, motivo per cui risulta efficace e sicura nel trattamento a lungo termine della tossicodipendenza da oppiacei e nel dolore cronico da moderato a severo. Nell&#39;Uomo, la buprenorfina viene ampiamente metabolizzata, tanto che solo una minima quota di molecola &#34;tal quale&#34; subisce processi di escrezione renale. La via metabolica principale consiste nella N-dealchilazione, processo catalizzato per un 80-90% dal citocromo P450, attraverso il quale si genera il metabolita norbuprenorfina. Infine, sia la buprenorfina che la norbuprenorfina subiscono un processo di glucuronazione epatica, da cui originano buprenorfina-3-glucuronato (B3G) e norbuprenorfina-3-glucuronato (N3G). <br>I vantaggi che una derivatizzazione in ambiente acquoso può apportare nelle analisi di tipo tossicologico forense, ma non solo, possono essere diversi, primo fra tutti la possibilità di evitare o comunque di ridurre al minimo la perdita di analiti particolarmente volatili come ad esempio le amfetamine durante le usuali fasi di estrazione pre-derivatizzazione. Altro indiscusso vantaggio è quello di poter derivatizzare le sostanze di interesse direttamente nella matrice in cui si trovano e questo può risultare particolarmente utile in tutti quei casi in cui l’estrazione delle sostanze come tali sia di difficile attuazione. Infine vi è anche il vantaggio di poter svolgere le operazioni di derivatizzazione in tempi molto più brevi rispetto alle normali tecniche utilizzate portando quindi ad un notevole risparmio di tempo.<br><br>SCOPO DELLA TESI<br>Lo scopo principale del lavoro è stato quello di riuscire a mettere a punto delle condizioni ottimali di derivatizzazione per le sostanze di nostro interesse in matrice ematica per poter poi validare la metodica ed applicarla per monitorare la presenza delle sostanze di interesse su campioni reali di sangue prelevati dalle Autorità competenti. Le metodiche analitiche che vengono utilizzate per l&#39;analisi di conferma della presenza delle sostanze d&#39;abuso nelle matrici biologiche devono essere validate prima di poter entrare nella routine di un laboratorio. La convalida si prefigge lo scopo di documentare le caratteristiche del metodo analitico al fine di permettere una valutazione obiettiva dei risultati. Di seguito vengono elencati i parametri che sono stati valutati:<br>- Specificità<br>- Limite di quantificazione (LOQ) e Limite di rivelazione (LOD)<br>- Linearità (o calibrazione)<br>- Precisione e accuratezza<br>- Recupero<br>PROCESSO DI DERIVATIZZAZIONE<br>L’agente derivatizzante impiegato è il propil–cloroformiato (PCF). Il grande vantaggio che il PCF offre rispetto agli agenti derivatizzanti comunemente utilizzati risiede nel fatto che può essere utilizzato direttamente nella fase acquosa, rendendo così l’estrazione dei derivati molto più agevole rispetto all’estrazione pre-derivatizzazione, soprattutto nel caso degli oppiacei dove abbiamo molecole con comportamento anfotero. La nuova metodica di derivatizzazione è stata messa a punto utilizzando come unico agente derivatizzante il propilcloroformiato direttamente nella matrice acquosa associandolo alla trietilammina (TEA) che ha come azione quella di catalizzare la reazione di derivatizzazione. La metodica è stata applicata su un volume ematico pari a 200 microlitri.<br>• 200 microlitri di sangue addizionato delle sostanze e dei loro analoghi deuterati<br>• deproteinizzazione mediante aggiunta, sotto agitazione su vortex, di 300 microlitri di acetonitrile<br>• separazione del coagulo mediante centrifugazione a 7000 rpm per 5 minuti<br>• sotto agitazione si aggiungono 30 microlitri di TEA<br>• successivamente, sempre su vortex, si aggiunge il solvente di estrazione ovvero il clorobutano<br>• si aggiungono 30 microlitri di PCF agente derivatizzante<br>• 3 ml di acqua <br>• si centrifuga a 7000 rpm per 5 minuti<br>• si recupera la fase organica che viene portata a secco mediante flusso di azoto a temperatura ambiente<br>• il residuo ottenuto viene ripreso con 50 µL di acetato di etile ed analizzato mediante GC-MS.<br><br>
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