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Riassunto
Il diabete mellito insulino-dipendente (IDDM o di tipo 1) è una patologia autoimmune che provoca la degenerazione delle cellule β del pancreas endocrino responsabili della produzione di insulina.
Esso si sviluppa in età giovanile e, a lungo termine, porta all’insorgenza di gravi complicazioni a carico del sistema cardiovascolare, renale e nervoso.
Attualmente la principale terapia per l’IDDM si basa sull’iniezione giornaliera di insulina.
Benché questa terapia abbia ridotto sensibilmente la mortalità, i pazienti spesso incorrono in complicazioni quali nefropatie, neuropatie angiopatie, retinopatie e possono essere soggetti ad episodi severi di ipoglicemia, in alcuni casi fatali.
Attualmente il trapianto di pancreas è l’unica terapia in grado di restaurare la normoglicemia e mantenere a lungo termine l’omeostasi del glucosio; inoltre tale procedura può migliorare la qualità della vita e far regredire alcune complicazioni del diabete.
Sebbene si sia visto che il trapianto di pancreas permetta di raggiungere l’indipendenza insulinica, la complessità della tecnica chirurgica espone il ricevente a numerosi e gravi rischi post operatori: trombosi dei vasi del trapianto, emorragie intra-addominali, pancreatiti dell’organo trapiantato, formazioni di fistole pancreatiche ecc. a seguito delle quali si può verificare una perdita del trapianto stesso.
Una promettente alternativa al trapianto dell’intero organo pancreatico è costituita dal trapianto portale di isole di Langherans.
Rispetto al trapianto di organo solido, il trapianto di isole presenta dei vantaggi, tra cui: procedura chirurgica relativamente semplice (chirurgia mini-invasiva) e, di conseguenza, bassi rischi post operatori. Nonostante ciò, la sua applicazione nella clinica rimane limitata, principalmente per il verificarsi di recidive autoimmuni rispetto al trapianto dell’intero organo pancreatico e degli effetti collaterali associati ai farmaci immunosoppressori usati.
Lavori recenti riportano che le Cellule Staminali Mesenchimali (MSC) sono in grado di modulare la risposta autoimmune nel trapianto allogenico e di prevenire la malattia verso l’ospite (GVHD).
L’ obiettivo di questo lavoro è stato quello di utilizzare le cellule staminali mesenchimali per ridurre il rigetto acuto nel trapianto di isole pancreatiche allogeniche e singeniche eseguito su ratti riceventi diabetici.
Abbiamo confrontato la capacità immunosoppressiva delle MSC con quella delle terapie farmacologiche convenzionali, valutando gli effetti sui livelli plasmatici di glucosio dopo il trapianto di isole.
A questo scopo sono stati eseguiti trapianti con una massa marginale di isole pancreatiche (700 IE) con dosi multiple di cellule staminali (3x150.000) e sono stati monitorati i livelli di glucosio negli animali trapiantati.
I risultati ottenuti sono stati confrontati con i gruppi di controllo nei quali sono state trapiantate sole isole pancreatiche, con i gruppi riceventi dosaggi più bassi di MSC e con i gruppi trattati con un protocollo immunosoppressivo farmacologico giornaliero di tipo tradizionale. Ulteriori informazioni sono state fornite da indagini istologiche e di risonanza magnetica condotte sugli animali trapiantati.
I dati ottenuti dimostrano che l’infusione sistemica di dosi multiple di MSC, associata al trapianto di isole, comporta una maggiore diminuzione dei valori glicemici e un loro prolungato mantenimento temporale sotto la soglia di diabete, fino a 15 giorni dopo il trapianto. Alla riduzione dei livelli di glucosio corrisponde una diminuzione parallela dei livelli di citochine pro-infiammatorie: INF-γ e GM-CSF nel sangue.
Al contrario, gli animali che ricevono soltanto una massa marginale di isole pancreatiche mostrano un rapido, ma transitorio, calo dei valori glicemici, che si mantengono superiori ai livelli ottenuti nel trattamento con MSC; anche i livelli di INF-γ e GM-CSF sono significativamente più alti che nei gruppi riceventi le MSC.
Le analisi istologiche condotte sui campioni di fegato prelevati dagli animali trapiantati hanno dimostrato che in presenza di MSC, l’infiltrazione linfocitaria a carico delle isole localizzate in sede epatica risulta essere notevolmente ridotta rispetto agli animali che non hanno ricevuto tale trattamento.
In conclusione l’efficacia delle iniezioni multiple di MSC nella prevenzione del rigetto è risultata paragonabile a quella della terapia immunosoppressiva farmacologica convenzionale.
Questi risultati indicano la possibilità di usare le MSC per modulare la risposta immunitaria e di prevenire il rigetto acuto e migliorare la funzionalità del graft sia nel trapianto allogenico, che in quello singenico di isole pancreatiche.
Successivamente si è cercato di migliorare l’homing delle MSC nel trapianto, avvalendosi delle nanotecnologie: in particolare sono stati utilizzati nanotubi di carbonio magnetici, per guidare le cellule staminali nell’organo bersaglio, in questo caso il fegato.
In collaborazione con il gruppo di Scienze mediche della Scuola Superiore Sant’Anna, (diretto dal Prof. Cuschieri), è stato eseguito uno studio in vitro per valutare eventuali effetti citotossici dei nanotubi sulle MSC, sulla loro vitalità e funzionalità.
A tale scopo, le MSC sono state coltivate per 5 giorni con MWCNT mantenendo le loro caratteristiche fenotipiche, la loro funzionalità e vitalità e sono state poi guidate in vitro utilizzando una sorgente magnetica esterna. Successivamente è stata messa a punto la tecnica chirurgica per effettuare i trapianti con le cellule staminali mesenchimali trattate con nanotubi, in presenza di una sorgente magnetica, allo scopo di localizzare le cellule nel fegato.
Ci proponiamo in seguito di effettuare ulteriori esperimenti in cui verranno realizzati trapianti di isole pancreatiche in associazione con MSC trattate con MWCNT, in presenza di un campo magnetico, allo scopo di trattenere le MSC nel fegato e di migliorare la loro efficacia nel controllo glicemico.

Abstract
Insulin-Dependent Diabetes Mellitus (IDDM or type 1) is an autoimmune, chronic disease characterised by hyperglycaemia, resulting from inflammatory infiltration of the islets of Langerhans. The selective destruction of β-cells leads to a lower insulin secretion from endocrine pancreas.
Type I diabetes begins early in life and leads to long-term complications throughout the body involving cardiovascular, renal, and nervous system disease.
The mainstay treatment for IDDM patients is chronic insulin injection. Although insulin therapy has dramatically reduced mortality from diabetes, patients often incur in complications such as nephropathy, neuropathy angiopathy and retinopathy. Moreover, patients are at risks of severe and sometimes fatal hypoglycaemic events.
Pancreas transplantation, is currently the only therapeutic approach which allows to restore normoglycaemia and maintains long-term glucose homeostasis this procedure can improve quality of life and even reverse some complications of diabetes. Although pancreas transplantation achieves insulin-independence, the complexity of the whole pancreas transplant procedure, exposes the recipient to a variety of significant operative and post-operative risks, including: thrombosis of graft vessels, intra-abdominal hemorrhage, graft pancreatitis.
An alternative to the replacement of whole pancreas is the transplantation of islet of Langherans cells, isolated from donor pancreata and embolized into the recipient liver via the portal vein. Compared to the solid organ transplantation the advantages of islet transplantation consist in the relatively simple surgical procedure (low invasive surgery) and low incidence of the peri-operative risks.
However, the recurrence of immune response after transplantation and the diabetogenic and growth-stunting side effects of immunosuppressants are major challenges to the application of islet transplantation.
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have recently been reported to modulate the immune response in allogeneic transplantation, preventing the graft-versus-host disease (GVHD).
In the present work we have used a rat model to investigate the ability of MSCs to preserve the function and prevent acute immune responses toward transplanted islet grafts either syngeneic or allogeneic. We have compared the immunosuppressive efficacies of MSCs and conventional immunotherapy by evaluating the effects on plasma glucose levels after islet transplantation.
In preliminary experiments 700 islet equivalents (IE) isolated from rat pancreata were transplanted into the portal vein of recipient diabetic rats (plasma glucose higher than 400 mg/dl) after 5 days from a single high dose (65 mg/kg) of streptozotocin (STZ).
The islet localization in the liver was confirmed by nuclear magnetic resonance imaging of islet labelled by the super paramagnetic contrast agent Resovist® .
Reduced glucose levels and low grade rejections were observed up to 15 days after transplantation of a marginal dose of islets (700IE) upon the multi-dose administration of 150,000 MSCs on day 0, 2 and 4 from transplantation (3x150,000), indicating that MSCs prolong graft function by preventing acute rejection.
MSCs efficacy was independent of the route of administration and comparable to that of immunosuppressive therapy in preventing graft rejection and reducing the blood levels of proinflammatory cytokines in allogeneic and syngeneic transplantation. The improvement in glycaemic control was paralleled by a significant reduction in lymphocyte infiltration of hepatic blood vessels and tissue, confirming the immunosuppressive action of MSCs.
These results indicate, the possibility of using MSCs to modulate the immune response, preventing acute rejection and improving graft function in syngeneic and allogeneic pancreatic islet transplantation.
One of the unresolved problems in the use of MSCs therapy relates to site specific homing of MSC to the organ of interest. Several studies in animal models have reported that, following systemic administration, MSCs distribute widely to a wide variety of organs and tissues especially after injury. This dispersion of the injected cells reduces the local effect on the target organ.
We have investigated the possibility to improve the localization of MSCs in the liver and to enhance their efficacy by using the multi-wall carbon nanotubes. To this aim we have cultured MSC with MWCNT for 5 days and we have demonstrated that cells maintain their biological activity in terms of viability and differentiation. Moreover they can be shepherded in vitro and guided towards the target organ in vivo by using an external magnetic field.
After that we have emploied a surgical technique in MSC-CNT transplantation in presence of a magnetic source, to localize cells into the liver.