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Tesi etd-05242010-000751


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
PORCIANI, DAVID
URN
etd-05242010-000751
Title
La strategia del “knock-down” genico per l’identificazione dei fattori chiave di processi fisiopatologici: progettazione, sintesi e caratterizzazione di un ribozima “hammerhead”.
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof. Citti, Lorenzo
relatore Prof.ssa Nieri, Paola
Parole chiave
  • catalisi ribozimi
  • costanti catalitiche
  • ribozyme
  • vascular smooth muscle cells
  • cellule muscolari lisce vascolari
  • conversione fenotipica VSMC
  • aterosclerosi coronarica
  • ristenosi
  • cinetica enzimatica
  • sintesi DNA
  • sintesi RNA
  • PDGF
  • knock-down genico
  • sintesi oligonucleotidi
  • ribozima hammerhead
  • ribozimi
  • ioni magnesio
  • cleavage reaction
  • caratterizzazione cinetica
Data inizio appello
09/06/2010;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
La cura della salute dei cittadini rappresenta un impegno sociale ed economico molto<br>pesante a carico delle diverse comunità. I progressi della conoscenza sulle origini, lo<br>sviluppo ed i meccanismi delle numerose patologie stanno fornendo sostanziali contributi<br>al miglioramento delle diagnosi, all’introduzione di terapie più efficaci ed alla<br>prevenzione. In particolare, le più recenti tecnologie d’indagine basate su analisi ad ampio<br>spettro di geni, proteine, e funzioni metaboliche (genomica, trascrittomica, proteomica,<br>metabolomica) sono in grado di fornire nuovi quadri interpretativi delle diverse<br>manifestazioni patologiche. Da questi quadri è possibile postulare meccanismi e fattori<br>chiave coinvolti nella patogenesi, nella progressione e negli esiti di una data malattia.<br>Tuttavia, trattandosi di deduzioni, le diverse ipotesi devono essere convalidate mediante<br>prove sperimentali opportunamente progettate. In questa prospettiva si colloca la<br>tecnologia del “knock-down” genico secondo la quale è possibile inibire<br>considerevolmente e in maniera selettiva un determinato gene. Il vantaggio di tale tecnica<br>risiede nel fatto che consente di verificare in maniera diretta il ruolo che quel gene riveste<br>in un preciso quadro metabolico evidenziabile con quel modello cellulare. Nel panorama<br>degli armamentari messi in campo, per il conseguimento del “knock-down” genico,<br>abbiamo scelto l’uso dei ribozimi “hammerhead”. Si tratta di corte sequenza di RNA,<br>dotate di attività endoribonucleasica, capaci di riconoscere, legare e scindere un mRNA di<br>cui si voglia ottenere l’inibizione.<br>In questa Tesi di Laurea, svolta presso il laboratorio di “Proteomica e Tecnologie<br>Genomiche” dell’istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, è stato affrontato il tema<br>della progettazione, sintesi e caratterizzazione di un ribozima “hammerhead” diretto contro<br>il gene che codifica il recettore PDGFR-β per il fattore di crescita PDGF (Platelet Derived<br>Growth Factor) nel maiale. La scelta riguarda la sua futura applicazione a cellule<br>muscolari lisce di coronaria di maiale (VSMC), che rappresentano un modello di studio di<br>patologie cardiovascolari. Poiché il PDGF sembra essere il più potente induttore<br>dell’attivazione patologica delle VSMC, l’inibizione del suo recettore rappresenta un buon<br>sistema di indagine utile per confermare il suo effettivo ruolo.<br>a) progettazione del ribozima sulla base della sequenza porcina<br>Durante la fase di progettazione di un ribozima hammerhead si devono prendere in<br>considerazione alcuni aspetti: è necessario che I) la sequenza bersaglio sia accessibile, II) il<br>ribozima sia stericamente “aperto”e III) le sequenze fiancheggianti non siano ripetute in<br>altri mRNA, per evitare qualunque effetto collaterale “off-target”. Per rispondere ai primi<br>due punti è cruciale la determinazione delle ipotetiche strutture ripiegate sia della molecola<br>di RNA bersaglio che della molecola di ribozima, escludendo dalla selezione le regioni<br>dell’RNA bersaglio coinvolte in strutture stabili ed in appaiamenti difficilmente accessibili<br>per il ribozima e i ribozimi con ripiegamenti anomali che impediscono la strutturazione<br>corretta del “core” catalitico.<br>A questo scopo abbiamo applicato un metodo computazionale di progettazione. Poiché le<br>banche genetiche internazionali contengono una mappa parziale del genoma di Sus scrofa,<br>e l’mRNA relativo al PDGFR-β presenta due porzioni limitate della sequenza, non<br>abbiamo potuto ricavare una valutazione rigorosa delle ipotetiche strutture secondarie<br>assunte dalla molecola bersaglio, né verificare l’unicità del sito di legame/scissione,<br>essendo il trascrittoma di maiale molto limitato. Nonostante la condizione poco favorevole,<br>con l’aiuto di un programma di calcolo, basato sulla termodinamica del ripiegamento delle<br>sequenze di RNA, abbiamo selezionato un sito di scissione, GUU, localizzato al nucleotide<br>288 della porzione nota dell’mRNA del PDGFR-β che sembrava favorevole. Su tale<br>sequenza è stato disegnato il ribozima e ne è stata decisa la sintesi.<br>b) sintesi e purificazione del ribozima e del suo bersaglio minimo<br>La sequenza catalitica del ribozima, precedentemente disegnata, è stata sintetizzata con due<br>diversi metodi:<br> Per via chimica mediante l’uso di un sintetizzatore di oligonucleotidi, che esegue cicli<br>di sintesi in maniera automatica. La sintesi avviene in fase solida, in condizioni anidre ed<br>in atmosfera inerte di Argon, sfruttando la chimica delle fosforoammiditi. La strategia di<br>sintesi prevede l’inserimento di un monomero alla volta ad una catena crescente e procede<br>in direzione 3’-5’, a differenza di quanto accade in ambito biologico. I monomeri utilizzati<br>sono β-cianoetil fosforoammiditi, caratterizzati dalla presenza di gruppi protettori sulle<br>basi azotate, sull’atomo di fosforo in posizione 3’ e sui gruppi idrossilici in posizione 2’e<br>5’.<br> Per via enzimatica. In questo caso, il primo passo è stato la preparazione del DNA<br>stampo, a singolo filamento, mediante sintesi chimica automatica. Successivamente, con<br>una reazione enzimatica di elongazione (DNA polimerasi) di un corto innesco di DNA<br>appaiato al singolo filamento di sintesi abbiamo potuto ottenere la specie a doppio<br>filamento, necessaria alla trascrizione “in vitro”. Il DNA a doppio filamento è stato<br>successivamente usato come stampo per la reazione enzimatica di trascrizione “in vitro”<br>mediante l’enzima T7 RNA polimerasi, in presenza di ribonucleotidi trifosfato.<br>Anche il bersaglio ribonucleotidico (sequenza minima) è stato preparato mediante sintesi<br>chimica. La scelta di una sequenza bersaglio minima è stata fatta nell’ottica di una sua<br>rapida utilizzazione nelle successive valutazioni sperimentali delle proprietà catalitiche del<br>ribozima. In questo caso, la sintesi per via enzimatica ha fornito prodotti con un basso<br>grado di purezza; probabilmente a causa di una minore efficienza dell’enzima usato per la<br>trascrizione, la cui “corsa” lungo lo stampo di DNA risulta più stabile (e quindi più<br>efficiente) quando il “binario” (il filamento di DNA) è più lungo. Sulla base<br>dell’esperienza fatta, il metodo di sintesi per via chimica è risultato preferibile al metodo di<br>sintesi per via enzimatica perché garantisce una maggiore purezza del prodotto con<br>rendimenti notevolmente più alti.<br>Il procedimento di recupero dei prodotti di sintesi prevede il distacco dalla fase solida sulla<br>quale è stata svolta la sintesi (vetro a porosità controllata) e la rimozione dei diversi<br>sostituenti presenti a protezione dei gruppi funzionali. Dopo la deprotezione i prodotti<br>ottenuti sono stati analizzati e purificati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione<br>(HPLC).<br>c) caratterizzazione del ribozima: quantificazione, efficienza catalitica<br>I prodotti purificati sono stati quantificati mediante misure di assorbimento UV a 260 nm.<br>In seguito il ribozima è stato caratterizzato dal punto di vista catalitico mediante misure di<br>tipo cinetico della reazione di scissione effettuata sul bersaglio minimo. Questo tipo di<br>studio ci ha consentito di dimostrare innanzitutto che il ribozima è effettivamente capace di<br>scindere l’RNA bersaglio. L’analisi delle proprietà cinetiche è stata realizzata utilizzando<br>un metodo cromatografico di misura che permette di separare il substrato dai prodotti di<br>cleavage mediante HPLC a scambio anionico. Con questo metodo abbiamo potuto<br>quantificare ad ogni tempo di misura del progresso della reazione, simultaneamente ed in<br>maniera accurata il substrato, i prodotti di scissione e il ribozima. I dati ottenuti sono stati<br>poi elaborati allo scopo di calcolare: le frazioni del bersaglio residuo e dei prodotti formati,<br>le velocità iniziali (v0), le relative Kobs, la costante di Michaelis-Menten Km e la costante<br>catalitica Kcat. Le proprietà cinetiche sono state studiate in condizioni di multiple turnover,<br>ovvero in eccesso di substrato rispetto al ribozima, a concentrazioni diverse di ioni<br>magnesio. Quest’ultimo, infatti, presenta un ruolo importante per l’attività del ribozima e il<br>suo contributo alla velocità della reazione di scissione è stato valutato.<br>d) conclusioni<br>I risultati ottenuti hanno mostrato l’effettiva capacità del ribozima, da noi realizzato, di<br>catalizzare la scissione dell’RNA bersaglio. Anche la dipendenza della sua attività rispetto<br>alla concentrazione di ioni magnesio, conferma la bontà del ribozima che presenta una<br>discreta funzionalità anche in condizioni sfavorevoli, di bassa concentrazione dello ione<br>metallico. Questo lavoro sperimentale dimostra la validità della metodica utilizzata in<br>termini di progettazione e sintesi del ribozima e al tempo stesso introduce metodiche molto<br>accurate per misurarne l’efficienza catalitica. Questo primo livello metodologico di sintesi<br>e caratterizzazione rappresenta il punto di partenza di una tecnologia di “knock-down”<br>genico, la cui tappa immediatamente successiva riguarderà la somministrazione a sistemi<br>biologici modello. In tal caso, l’azione catalitica dovrà trasformarsi in un effetto biologico<br>misurabile e indicativo dell’inibizione della funzione “bersaglio” prescelta. Questo naturale<br>completamento del progetto aprirà le porte all’utilizzo dei ribozimi a fini investigativi,<br>nella convalida del ruolo di marcatori di patologia, e nell’identificazione di nuovi bersagli<br>terapeutici, per l’inibizione di anomalie fisiopatologiche.
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