• GSTO1
• HeLa
• triossido d'arsenico

Le glutatione transferasi (GST) citosoliche umane rappresentano la famiglia più ampia ed eterogenea di GST. Si dividono in sette classi, di cui la classe omega (GSTO) è quella di più recente identificazione. La GSTO umana è presente in due forme, cui è stato dato il nome di GSTO1 e GSTO2.
La GSTO1, è una proteina implicata nella risposta allo stress cellulare, e presenta peculiari caratteristiche strutturali verosimilmente responsabili delle sue attività peculiari enzimatiche: non mostra attività glutatione transferasica ma ha attività tiol-transferasica, monometil e dimetilarseniato reduttasica e deidroascorbato reduttasica. In letteratura viene descritto come la sovra-espressione della GSTO1 renda le cellule HeLa resistenti al trattamento con cisplatino, mentre la sotto-espressione di tale proteina, di contro, le rende più sensibili all’azione del chemioterapico. Sono state indagate le vie coinvolte, ed è stato visto che il ruolo della GSTO1 nella risposta al cisplatino è dovuto alla sua capacità di attivare vie anti-apoptotiche e di inibire le vie pro-apoptotiche. Da qui sono stati condotti successivi esperimenti finalizzati a studiare il ruolo della proteina GSTO1 nei confronti del triossido d’arsenico (ATO). L’arsenico è un comune contaminante ambientale, con diversi effetti tossici su cellule e tessuti; sulla base dello specifico tessuto esposto e della durata dell’esposizione si possono sviluppare diverse risposte. Nell’uomo, ad esempio, un’esposizione prolungata ad alte dosi di arsenico può provocare diverse conseguenze incluso lo sviluppo di neoplasie, di severa tossicità gastrointestinale, diabete, aritmie cardiache fino a provocare la morte. Accanto agli effetti tossici, un derivato dell’arsenico, il triossido dell’arsenico (ATO, As2O3), ha però importanti proprietà anti-tumorali; da secoli è utilizzato nella medicina cinese e recentemente l’ATO è diventato cura di elezione per la leucemia promielocitica acuta e la sua diffusione come chemioterapico si sta ampliando anche ad alcune forme di tumori solidi come ad esempio i gliomi. Il ruolo della GSTO1 nella risposta al trattamento con triossido d’arsenico potrebbe essere più complesso rispetto a quello con il cisplatino. La GSTO1 potrebbe modulare la citotossicità dell’arsenico tramite due meccanismi tra di loro contrastanti. E’ stato dimostrato che la GSTO1 corrisponde alla monometilarseniato reduttasi, enzima responsabile della produzione dell’acido metilarsenioso, cioè del metabolita più tossico dell’arsenico. La sovra-espressione della GSTO1 potrebbe perciò incrementare la tossicità dell’ATO. I dati preliminari a questa tesi però mostrano che la sovra-espressione della sequenza della GSTO1 wild type in diverse linee cellulari (HeLa, U937, HL60) induce un aumento della resistenza al trattamento con ATO. Le cellule HeLa hanno mostrato invece un comportamento anomalo quando la GSTO1, normalmente sovra-espressa dalle cellule quando raggiungono la confluenza, viene silenziata tramite siRNA: anziché diventare più sensibili come ci si aspetterebbe diventano più resistenti al trattamento con il tossico. Tale comportamento non si osserva nelle altre linee cellulari esaminate. Questo ci ha fatto ritenere che nella GSTO1 espressa dalle HeLa fosse presente una mutazione o un polimorfismo responsabile del comportamento anomalo.
Lo scopo della mia tesi è stato quello di cercare un eventuale polimorfismo. Fra i più noti della GSTO1 presenti in letteratura: A140D (transizione C>T) e E155del (delezione di 3bp, esone 4-introne). Di fatto è stata dimostrata la presenza del polimorfismo A140D (in omozigosi) nella sequenza della GSTO1 mediante RFLP (restriction fragment length polymorphism). Al fine di comprendere se il polimorfismo fosse realmente responsabile del comportamento anomalo delle HeLa nei confronti del triossido d’arsenico, il cDNA della GSTO1 è stato clonato nel vettore di espressione pIRES. Tale vettore è stato utilizzato per indurre nelle cellule HeLa una sovraespressione della proteina polimorfica mediante transfezione al fine di confrontare la sua azione con quella della GSTO1 wild type, in risposta al trattamento con ATO. Riuscire a capire come la sovraespressione e la presenza o meno del polimorfismo A140D della GSTO1 possa influenzare la resistenza delle cellule tumorali al trattamento con ATO potrebbe essere infatti d’ausilio nello scegliere la terapia più idonea per i vari pazienti; ovvero se un paziente presenta il polimorfismo A140D della GSTO1 risponderà meglio alla chemioterapia con ATO rispetto ad un paziente con GSTO1 WT.
I risultati dei saggi di citotossicità condotti mostrano come effettivamente la GSTO1 wild type protegga le cellule anche alle dosi più alte di ATO, mentre la sovraespressione della sequenza con il polimorfismo A140D renda le cellule più sensibili al trattamento. Il silenziameno di quest’ultima, invece, rende le cellule significativamente più resistenti rispetto a quelle in cui è mantenuta la sua espressione anche se sempre molto meno rispetto alle cellule in cui viene espressa la sequenza WT. Al fine di valutare il tipo di morte cellulare sono stati condotti esperimenti diversi. La colorazione con Hoechst, così come il saggio di esternalizzazione dell’annessina V ci hanno permesso di valutare i livelli di apoptosi, mentre il saggio con arancio acridina e LC3 i livelli di autofagia. I risultati di questi esperimenti hanno mostrato che nel nostro modello sperimentale il tipo di morte cellulare che viene indotta dal trattamento con l’ATO non è né di tipo apoptotico né autofagico. Sono attualmente in corso studi di microscopia elettronica per riuscire a capire qual è il tipo di morte cellulare.
Per studiare i meccanismi responsabili della risposta delle HeLa all’ATO, sono state analizzate, mediante esperimenti di immunoblotting, le vie di ERK, p-38 e JNK implicate nei meccanismi di resistenza della wild type e di sensibilità della polimorfica, nelle rispettive linee cellulari che le sovra-esprimono, Dai primi dati ottenuti sembra che la GSTO1 polimorfica non riesca ad indurre l’attivazione delle vie di sopravvivenza analizzate, mentre sembrerebbe in grado di farlo la sequenza wild type. D’altra parte gli effetti osservati potrebbero anche dipendere da una diversa capacità dei due enzimi di metabolizzare L’ATO. Tutto ciò rimane ancore oggetto d’immagine.