• GFP
• costante diffusione IgG
• chiarificazione tissutale
• cervello murino
• ottimizzazione CLARITY

La presenza di lipidi nei tessuti biologici, come il cervello dei mammiferi, causa una significativa dispersione della luce, ed è quindi uno dei principali fattori limitanti per scopi di imaging (ad es confocale acquisizioni). Tra i vari metodi proposti per ovviare a questo problema ,il metodo CLARITY, basato sulla rimozione dei lipidi deal tessuto e la loro sostituzione con un idrogel otticamente trasparente, è molto interessante in quanto consente l’imaging dei sistemi intatti senza cambiarne morfologia o proprietà biochimiche. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per chiarificare cervelli interi, ottenendo tessuto cerebrale intatto e otticamente trasparente. Tuttavia, l’elevato numero di step coinvolti e di variabili sperimentali rende il metodo CLARITY fortemente dipendente dall’utente e difficile da standardizzare. Pertanto, una versione semplificata di tale metodo, chiamata CLARITY2 , è stata proposta pe chiarificare fette di spessore 1-1.5 mm ottenute da cervello incluso in idrogel, semplicemente immergendo tali fette incluse in una soluzione di chiarificazione. Nel mio lavoro di tesi, viene proposta un’ottimizzazione rigorosa del protocollo CLARITY2 per fette di cervello spesse 1mm ottenute da poti L7GFP,le cui cellule del Purkinje esprimono la proteina fluorescente verde (GFP). Le fette sono state mantenute nella soluzione di chiarificazione per 3, 5, e 7 giorni. Per ogni gruppo , il risultato della chiarificazione è stato valutato sia mediante imaging macroscopica (quantificando la trasparenza della fetta), sia tramite acquisizioni al confocale. Inoltre, la perdita di GFP nella soluzione di chiarificazione è stata quantificata ed usata assieme ai dati provenienti da imaging per identificare la durata ottimale del processo di chiarificazione. Tutti i risultati sono stati confrontati con fette non trattate, usate come controllo. I dati ottenuti mostrano che trattare le fette per più di 5 giorni non migliora la chiarificazione tissutale, ma provoca soltanto un’inevitabile perdita di GFP nella soluzione di chiarificazione. Pertanto, 5 giorni di chiarificazione rappresentano il miglio compromesso in termini di chiarificazione tissutale e preservamento del target (GFP). Infine, dato che la maggior parte delle metodiche di imaging è basata su colorazione tissutale con anticorpi fluorescenti, è stata valutata la costante di diffusione di una immunoglobulina G (IgG) marcata con un fluoroforo all’interno di un tessuto cerebrale chiarificato, in modo da definire i tempi di sperimentali per una colorazione ottimale del tessuto, tali da garantire una completa diffusione degli anticorpi all’interno di tutto lo spessore della fetta.