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I gliomi maligni, di cui fanno parte il glioblastoma multiforme e l’astrocitoma anaplastico, rappresentano i più comuni tumori primari del cervello e nonostante la resezione chirurgica, la radioterapia e la chemioterapia, la prognosi per i pazienti colpiti rimane infausta. Persiste quindi la necessità di trovare nuove terapie.
Il mitocondrio, e le attività ad esso correlate, sono oggetto centrale di ricerche atte ad individuare nuove cure per diversi tipi di tumori. Esistono infatti molteplici differenze, relative al mitocondrio e al suo funzionamento, tra le cellule tumorali e le controparti normali.
In questo contesto, questo lavoro di tesi si è concentrato sullo studio del ruolo della proteina mitocondriale ANT nella biologia delle cellule di glioma, soprattutto in vista delle sue rilevanti funzioni sia nel metabolismo cellulare che nella regolazione dei processi di morte.
La proteina ANT, oltre al suo principale ruolo di trasportatore di nucleotidi adeninici a cavallo della membrana mitocondriale interna, ha anche un ruolo chiave sia nella formazione e nella regolazione del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (PTPC), che nella conduttanza protonica come proteina disaccoppiante della catena di trasporto degli elettroni.
Nell’uomo si conoscono quattro isoforme della proteina ANT. La loro espressione dipende sia dallo stadio di sviluppo che dal tipo di tessuto. In particolare ANT1 è altamente espressa nei tessuti differenziati mentre ANT2 è prevalentemente espressa nelle cellule indifferenziate e nei tumori.
Il sistema modello utilizzato in questo studio è la linea cellulare ADF di glioblastoma multiforme umano, cellule altamente aggressive e resistenti alle terapie standard attualmente in uso. In questo lavoro abbiamo inoltre dimostrato che, sebbene le cellule ADF hanno una catena di trasporto degli elettroni parzialmente attiva, esse utilizzano quasi esclusivamente la glicolisi per produrre ATP.
Mediante studi di RT-PCR e real-time RT-PCR abbiamo dimostrato che queste cellule esprimono le isoforme ANT1 e 2 e che l’ isoforma 2 è predominante rispetto alla 1.
Mediante i nostri studi di interferenza genica abbiamo dimostrato che, nonostante ANT2 sia 5 volte più abbondante di ANT1, il suo silenziamento o la sua sovraespressione non hanno effetti sulla vitalità cellulare. Invece, il silenziamento di ANT1 provoca una drastica riduzione della vitalità cellulare mediante l’induzione di morte apoptotica. Mediante l’utilizzo di inibitori della funzione di co-trasporto dei nucleotidi adeninici abbiamo dimostrato che l’effetto del silenziamento di ANT1 sulla vitalità cellulare è indipendente dal suo ruolo di trasportatore. Inoltre l’utilizzo dell’inibitore dell’ apertura del PTPC ha permesso di dimostrare che l’effetto del silenziamento di ANT1 è anche indipendente dal suo coinvolgimento nella formazione e regolazione del PTPC.
Studi sulla stabilità delle membrane lisosomiali, saggi dose-risposta al trattamento con pro-ossidanti e la quantificazione del glucosio consumato ci hanno permesso di intuire che, quando la proteina ANT viene silenziata, le cellule ADF sono sottoposte a stress ossidativo. Ciò ci permette di ipotizzare che la riduzione della vitalità prodotta dal silenziamento di ANT1 sia dovuta ad un aumento di ROS mitocondriali causato dalla perdita della funzione di ANT1 come proteina disaccoppiante. La riduzione della funzione disaccoppiante potrebbe infatti giocare un ruolo chiave nelle cellule ADF dove, data l’assenza di fosforilazione ossidativa, la riduzione della conduttanza basale (operata specificamente dalla l’isoforma ANT1) potrebbe comportare un aumento significativo del potenziale transmembrana mitocondriale il cui valore è direttamente dipendente alla produzione di ROS.
Questi ritrovamenti suggeriscono che in cellule di glioma con metabolismo preferenzialmente glicolitico, recentemente ritenute le principali responsabili della invasività dei tumori cerebrali, la riduzione dei livelli di ANT1 potrebbe rappresentare una potenziale strategia terapeutica.