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L‘esaclorocicloesano (HCH) è una molecola organica di sintesi largamente impiegata a partire dai primi anni ’40 del 900 come insetticida ad ampio spettro. Il processo di sintesi della molecola produce un elevato numero di isomeri, di cui i principali sono quattro, denominati alfa, beta, gamma e delta; la miscela dei suddetti isomeri prende il nome di esaclorocicloesano tecnico (tHCH). Unicamente l’isomero gamma, meglio conosciuto come Lindano, presenta proprietà insetticide, di fatto, già a partire dagli anni ’50, all’impiego del tHCH in agricoltura si è sostituito quello del Lindano purificato, la cui produzione comporta, tuttavia, l’accumulo di grandi quantità di isomeri “di scarto”, che sono stati ammassati nel corso degli anni nei suoli limitrofi alle aziende produttrici. L’HCH risulta essere estremamente recalcitrante alle biodegradazioni, è tossico per pesci, invertebrati acquatici, api ed uccelli e mostra effetti cancerogeni, oltre ad agire come interferente endocrino, sui mammiferi, rappresentando un pericolo concreto per l’uomo, così come per gli ecosistemi acquatici e terrestri. Per questo motivo, ad oggi, produzione ed utilizzo dell’HCH risultano vietati all’interno dell’Unione Europea; nonostante ciò, le zone agricole nelle quali è stato impiegato, così come quelle di produzione, risultano essere tutt’ora fortemente contaminate dalla molecola. Una soluzione alla problematica potrebbe derivare dall’impiego di microorganismi in grado di metabolizzare il complesso di isomeri che vanno a costituire il tHCH.

Questo lavoro di tesi ha come obiettivo l’isolamento di consorzi microbici multi-specie in grado di degradare i vari isomeri che compongono l’esaclorocicloesano tecnico, oltre ad analizzare le modalità con le quali tali consorzi tendono ad evolversi durante la fase di arricchimento e valutare eventuali effetti legati a concentrazioni crescenti di tHCH e alla presenza di glucosio come fonte di carbonio additiva nel mezzo di crescita. A tale scopo sono stati selezionati due campioni di suolo a partire da un ventaglio di dodici, tutti afferenti al SIN di Colleferro, comune della Regione Lazio che ha ospitato in passato un impianto di produzione di tHCH. I due campioni di suolo sono stati aliquotati ed utilizzati come inoculo per due colture di arricchimento ciascuno; la prima coltura di arricchimento presentava tHCH come unica fonte di carbonio, alla concentrazione di 10 mg/L, mentre alla seconda è stato addizionato glucosio allo 0.1% (p/v). Il mezzo di crescita delle colture di arricchimento è stato rinnovato ogni 4 settimane e, a partire dalla diciottesima settimana, la concentrazione di tHCH nel mezzo è stata aumentata a 50 mg/L. Aliquote di mezzo di crescita sono state prelevate a 10, 18, 22 e 26 settimane, per poi ottenere il profilo tassonomico della comunità batterica ai vari tempi mediante metabarcoding quantitativo del 16S rDNA. Al termine della ventiseiesima settimana sono stati isolati in coltura pura diversi ceppi batterici a partire dalle colture di arricchimento, e testati per la loro capacità di crescita utilizzando tHCH come unica fonte di carbonio. È stata, inoltre, portata avanti una analisi quantitativa delle cinetiche di degradazione dei 4 isomeri principali dell’esaclorocicloesano mediante GC-MS.

I risultati ottenuti mostrano come il suolo di partenza giochi un ruolo chiave nel determinare i taxa batterici che andranno a comporre il consorzio finale, inoltre evidenziano un effetto positivo legato alla presenza di glucosio come fonte additiva di carbonio, che sembra essere in grado di promuovere una aumentata capacità di adattamento a condizioni stressanti, legate nel caso specifico ad un incremento delle concentrazioni di tHCH nel mezzo di crescita. Tutti e quattro i microbioti isolati mediante la procedura di arricchimento adottata sono risultati competenti nella biodegradazione dei quattro principali isomeri del tHCH, mostrando una degradazione completa di alfa, gamma e delta esaclorocicloesano entro dieci giorni di crescita, e dal 50 al 75% dell’isomero beta, estremamente recalcitrante, in soli venti giorni.

Una analisi di questo tipo risulta di interesse nella messa a punto di protocolli di isolamento progressivamente più efficaci per l’ottenimento di consorzi microbici complessi con potenziale biotecnologico elevato.



[ENG]
Hexachlorocyclohexane (HCH) is a synthetic organic molecule widely used since the early 1940s as a broad-spectrum insecticide. The synthesis process of the molecule produces a large number of isomers, of which the main ones are four, called alpha, beta, gamma and delta; the mixture of the aforesaid isomers takes the name of technical hexachlorocyclohexane (tHCH). Only the gamma isomer, better known as Lindane, has insecticidal properties, in fact, as early as the 1950s, the use of tHCH in agriculture was replaced by that of purified Lindane, the production of which however involves the accumulation of large quantities of "waste" isomers, which have been amassed over the years in the soils adjacent to the manufacturing companies. HCH appears to be extremely recalcitrant to biodegradation, is toxic to fish, aquatic invertebrates, bees and birds and shows carcinogenic effects, as well as acting as an endocrine disruptor, on mammals, representing a concrete danger for humans, as well as for ecosystems aquatic and terrestrial. For this reason, to date, the production and use of HCH are prohibited within the European Union; despite this, the agricultural areas in which it was used, as well as the production areas, are still heavily contaminated by the molecule. A solution to the problem could derive from the use of microorganisms capable of metabolizing the complex of isomers that make up the THCH.

This thesis work has as its objective the isolation of multi-species microbial consortia capable of degrading the various isomers that make up the technical hexachlorocyclohexane, as well as analyzing the ways in which these consortia tend to evolve during the enrichment phase and evaluating any effects related to increasing concentrations of tHCH and the presence of glucose as an additive carbon source in the growth medium. For this purpose, two soil samples were selected from a range of twelve, all pertaining to the SIN of Colleferro, a municipality in the Lazio Region which in the past hosted a tHCH production plant. The two soil samples were aliquoted and used as inoculum for two enrichment cultures each; the first enrichment culture had tHCH as the only carbon source, at a concentration of 10 mg/L, while the second was added glucose at 0.1% (w/v). The growth medium of the enrichment cultures was renewed every 4 weeks and, starting from the 18th week, the concentration of tHCH in the medium was increased to 50 mg/L. Aliquots of growth medium were taken at 10, 18, 22 and 26 weeks, to then obtain the taxonomic profile of the bacterial community at various times by quantitative metabarcoding of 16S rDNA. At the end of the twenty-sixth week different bacterial strains were isolated in pure culture starting from the enrichment cultures, and tested for their growth capacity using tHCH as the sole carbon source. Furthermore, a quantitative analysis of the degradation kinetics of the 4 main isomers of hexachlorocyclohexane by GC-MS was carried out.

The results obtained show how the starting soil plays a key role in determining the bacterial taxa that will make up the final consortium, furthermore they highlight a positive effect linked to the presence of glucose as an additive source of carbon, which seems to be able to promote increased ability to adapt to stressful conditions, linked in the specific case to an increase in the concentrations of tHCH in the growth medium. All four microbiota isolated by the adopted enrichment procedure were found to be competent in the biodegradation of the four major isomers of tHCH, showing complete degradation of alpha, gamma and delta hexachlorocyclohexane within ten days of growth, and 50 to 75% of the isomer beta, extremely recalcitrant, in just twenty days.

An analysis of this type is of interest in the development of progressively more effective isolation protocols for obtaining complex microbial consortia with high biotechnological potential.