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Tesi etd-05172013-101459


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
CONCIALDI, SILVIA
URN
etd-05172013-101459
Title
Induzione del differenziamento di cellule mesenchimali staminali ad osteoblasti attraverso la modulazione allosterica del recettore A2B dell'adenosina
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
correlatore Dott.ssa Giacomelli, Chiara
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
Parole chiave
  • mesenchymal stem cells
  • differentiation
  • A2B
  • osteoblast
Data inizio appello
12/06/2013;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
12/06/2053
Riassunto analitico
L’osso è un tessuto dinamico, preservato nella sua integrità attraverso un ciclo continuo di riassorbimento e neo-formazione; il processo di riassorbimento è mediato dagli osteoclasti mentre quello di neo-formazione dagli osteoblasti. Con l’invecchiamento, si assiste ad uno squilibrio tra riassorbimento osseo e sua rigenerazione, con conseguente sviluppo di patologie quali l’osteoporosi. L’osteoporosi, caratterizzata da una ridotta densità minerale ossea e da alterazioni nella micro-architettura dell’osso, determina una maggior predisposizione al rischio di fratture che, rappresentando una delle più comuni cause di disabilità, compromettono in modo rilevante la qualità della vita. Le attuali terapie, impiegate nella cura di questa patologia, sono rivolte a ridurre la perdita ossea, contrastando il processo di riassorbimento. Per ripristinare la completa funzionalità dell’osso, però, sarebbe utile l’uso di farmaci ad azione anabolica, capaci di rigenerare questo tessuto connettivo specializzato; la ricerca, negli ultimi anni, sta volgendo l’interesse in questa direzione.<br>La formazione dell’osso è promossa da vari fattori tra cui le BMP (bone morphogenic proteins) 2, 4 e 7, i ligandi Wnt ed i fattori di crescita come IGF (insulin-like growth factor). Questi fattori promuovono il differenziamento delle MSC (mesenchymal stem cells) ad osteoblasti, aumentando l’espressione dei fattori di trascrizione, come Runx-2, fondamentali per l’osteogenesi. Tra le principali strategie per ottenere un effetto anabolico sono in studio composti che promuovono l’attivazione della via di trasduzione Wnt / β-Catenina, sia in modo diretto che indiretto, e composti che promuovono l’espressione di BMP-2 (i.e. le statine e l’ossitocina). Tuttavia il principale limite di queste molecole è la non specificità e la loro breve emivita. <br>Recentemente, è emerso il coinvolgimento nel differenziamento delle MSC ad osteoblasti del recettore adenosinico A2B. In particolare questo recettore induce il differenziamento di queste cellule multi-potenti ad osteoblasti; la sua espressione infatti è transientemente up-regolata durante le prime fasi del differenziamento, mentre nelle fasi tardive è up-regolato il recettore adenosinico A2A, responsabile della maturazione degli osteoblasti e del mantenimento del loro fenotipo. <br>L’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare nuovi ligandi, modulatori allosterici positivi per il recettore A2B, come agenti osteogenici. L’uso di un modulatore allosterico positivo per stimolare l’A2B e promuovere la formazione degli osteoblasti sarebbe, infatti, più vantaggioso dell’uso di un agonista diretto in quanto, sinergizzando con l’adenosina endogena e quindi avendo un’azione più sito ed evento specifica, consentirebbe l’utilizzo di dosi efficaci minori e la riduzione degli effetti collaterali. <br>In studi precedenti, una serie di ligandi, sintetizzati nel laboratorio del Prof. Da Settimo, sono stati individuati come modulatori allosterici positivi per il recettore A2B. In questo lavoro di tesi, uno di questi composti, LUC 1242, è stato ulteriormente indagato mediante una caratterizzazione farmacologica in cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) trasfettate stabilmente con tale recettore. Successivamente, lo stesso composto è stato caratterizzato in cellule MSC, mediante studi funzionali, dimostrando che anche in questo sistema cellulare il LUC 1242 mantiene la sua azione allosterica positiva. <br>Una volta caratterizzato il profilo del composto come modulatore allosterico positivo, è stato valutato il suo effetto sul differenziamento delle MSC ad osteoblasti, valutando il grado di mineralizzazione della matrice ossea. I risultati ottenuti hanno mostrato che il composto è capace di potenziare l’effetto, stimolante il differenziamento ad osteoblasti, dell’agonista non selettivo NECA e dell’agonista A2B selettivo BAY 60-6583. Inoltre per assicurarsi che l’effetto fosse dovuto all’attivazione del recettore A2B, è stato utilizzato l’antagonista selettivo MRS 1706 15 nM; questo ligando è risultato capace di bloccare completamente il differenziamento indotto dall’agonista A2B, sia in assenza che in presenza di LUC 1242, confermando quindi che l’azione è mediata in modo specifico dall’attivazione di tale recettore.<br>Per confermare il sinergismo tra il composto ed i ligandi A2B ortosterici sul differenziamento delle MSC ad osteoblasti, è stata valutata l’espressione dei geni marker del differenziamento (Runx-2, Osterix, alcalina fosfatasi ed osteocalcina). I risultati della real-time PCR hanno mostrato che LUC 1242 potenzia l’espressione di questi geni marker dell’osteoblastogenesi, incrementando quindi il differenziamento indotto dall’agonista.<br>Infine, per vedere se l’agonista e il modulatore allosterico positivo, oltre a stimolare il differenziamento, fossero anche capaci di promuovere la sopravvivenza degli osteoblasti maturi, dopo un differenziamento di 15 e 21 giorni, è stata valutata la vitalità delle MSC con il saggio colorimetrico dell’MTS. I dati ottenuti dimostrano che entrambi i composti sono capaci di diminuire la morte cellulare alla quale, in parte, le cellule MSC differenziate vanno incontro, e che la loro azione è sinergica.<br>Dai dati da noi ottenuti, si evince il ruolo fondamentale del recettore A2B sia nella differenziazione delle MSC ad osteoblasti sia nell’aumento della loro sopravvivenza. Inoltre emerge come il composto da noi preso in esame (LUC 1242) possa efficacemente potenziare tutti gli effetti mediati dall’attivazione del recettore A2B. <br>Possiamo quindi concludere che la stimolazione del recettore adenosinico A2B, mediata dall’uso di un modulatore, possa essere una potenziale nuova strategia terapeutica nella cura dell’osteoporosi, favorendo l’attività endogena dell’adenosina nella formazione dell’osso.<br>
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