• asino
• colorazione vitale (DAPI)
• qualità dell’embrione
• vitrificazione

Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l’effetto della vitrificazione sulla vitalità di embrioni di asino in comparazione con embrioni freschi mediante l’uso di un test in vitro che permette di contare le cellule morte (colorazione con DAPI). Dodici embrioni di 7 giorni sono stati recuperati su un totale di 22 cicli (54,5%) e 26 ovulazioni (46,1%), da sei asine di razza Amiatina mantenute presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa. Gli embrioni recuperati sono stati misurati, valutati morfologicamente e sottoposti a 5 lavaggi in un medium di mantenimento (EHS) prima di essere suddivisi in due gruppi: freschi e vitrificati. Gli embrioni del primo gruppo sono stati direttamente incubati con DAPI, mentre gli embrioni del secondo gruppo sono stati vitrificati, mediante un kit commerciale per la vitrificazione di embrioni equini, scongelati e poi colorati con DAPI. Il numero totale di cellule in ogni embrione è stato stimato attraverso la formula n=0,0106*d2+2,0542*d-375,28 (d=diametro embrione), sono state poi contate le cellule morte e calcolata la loro percentuale risultata pari a 0,7% per gli embrioni freschi e pari al 9% per quelli vitrificati (P=0,022). La percentuale di cellule danneggiate negli embrioni freschi è stata irrisoria e affine a quella riportata in studi precedenti, mentre quella degli embrioni vitrificati, seppur significativamente più alta, è risultata sensibilmente inferiore a quella che in letteratura è riportata come limite di vitalità per l'embrione equino (20%). I risultati incoraggianti di questo studio necessitano di essere confermati su un numero maggiore di embrioni e, soprattutto, per mezzo della verifica della percentuale di gravidanza che è possibile ottenere trasferendo nelle riceventi embrioni di asino crioconservati.

The aim of this thesis was to compare the donkey embryo fresh or vitrified viability using DAPI, able to selectively stain dead embryo cells. Twelve seven-days-old embryos , recovered from 22 estrous cycles (54.5%) and 26 ovulations (46.1%) of six Amiata jennies maintained in the Department of Veterinary Science, University of Pisa . Recovered embryos were measured, assessed morphologically, and washed for 5 times in an holding medium (EHS) before being divided into two groups: fresh and vitrified. The embryos of the first group were directly incubated with DAPI; the second group’s embryos were vitrified, using an equine embryos vitrification commercial kit. Vitrified embryos were then thawed and stained with DAPI. The total number of cells from each embryo was estimated using the correlation n = 0,0106*d2+2,0542*d-375,28 (d = embryo diameter). The dead cell number (marked with DAPI) was counted under inverted phase microscope and the dead/total cell ratio calculated: about 0.7% for fresh embryos and 9% for vitrified (P=0,022). The percentage of damaged cells in fresh embryos was negligible and similar to what is reported in previous studies, while for vitrified embryos, despite higher, was significantly lower than what in literature is reported as the limit of viability for the equine embryo (20%). The encouraging results of this study need to be confirmed on a larger number of embryos and, above all, verified by the resulting pregnancy rate after transfer of vitrified embryos in recipient jennies.