• micronuclei
• biodosimetria
• rete neurale

L’effetto biologico radioindotto più consistente risulta essenzialmente in danni al DNA, che è il bersaglio critico della radiazione; questi danni possono manifestarsi sottoforma di aberrazioni cromosomiche e di micronuclei, cioè parti di cromosomi, o interi cromosomi, che sono persi dal nucleo durante la mitosi e che si manifestano come piccole porzioni di cromatina al di fuori del nucleo principale di una cellula.
In particolare, il conteggio del numero di micronuclei in linfociti da sangue periferico è oramai utilizzato da molti anni in tutto il mondo come biomarker di danno cromosomico per studi biodosimetrici. Sebbene il test del micronucleo sia ben validato e facile da realizzare, essendo semplice contare le cellule interessate, l’applicabilità su larga scala per il biomonitoraggio ambientale è ostacolata dalla mancanza di tecnologie ad alto rendimento. Il conteggio visivo dei micronuclei può essere molto dispendioso in termini di tempo se si pensa che devono essere analizzati un gran numero di cellule e di donatori per ottenere dati statistici rilevanti, specialmente per il monitoraggio di popolazioni caratterizzate da basse frequenze di fondo di micronuclei come i bambini. Inoltre, anche sotto condizioni sperimentali ottimizzate, spesso si osserva un’alta variabilità inter-osservatore con un’analisi visiva cellulare. L’automatizzazione del test del micronucleo
sembra, quindi, un’esigenza da mettere a punto il prima possibile perché fornirebbe un’analisi delle frequenze di comparsa dei danni cromosomici più veloce e più affidabile, minimizzando gli effetti negativi di una identificazione soggettiva degli stessi.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è, quindi, lo sviluppo di un’architettura software in Java per l’implementazione semiautomatica della catalogazione di cellule linfocitarie umane e del test del micronucleo.
La prima parte del lavoro ha riguardato la messa a punto e l’ottimizzazione di un framework java per l’elaborazione di bioimmagini cellulari al fine di estrarre, dalle cellule presenti, parametri rilevanti da utilizzare per la loro successiva catalogazione mediante rete neurale. Il software è stato implementato in ambiente NetBeans.
Il framework in questione prevede l’applicazione di diverse maschere e di operatori morfologici e si articola in due fasi principali: la prima è finalizzata alla segmentazione automatica delle cellule dal background, mentre nella seconda vengono segmentati i nuclei all’interno di ogni cellula individuata nella fase precedente.
In una seconda fase dello studio, i parametri estratti dall’analisi di tutte le immagini sono stati mandati in ingresso ad un classificatore formato da due reti neurali in parallelo ed addestrato per il riconoscimento dei tipi cellulari che maggiormente interessano nel conteggio: cellule mononucleate e cellule binucleate. Le due reti neurali utilizzate sono state modificate ed ottimizzate in modo da fornire le migliori prestazioni per la classificazione cellulare. Sono state inoltre valutate le capacità delle reti di clusterizzare lo spazio degli ingressi, ovvero si è stimata la possibilità di allontanamento da un determinato pattern di parametri riuscendo a mantenere la stessa catalogazione cellulare, e l’andamento della correttezza delle risposte fornite in funzione della dimensione del training set.
La terza ed ultima parte del lavoro ha riguardato la creazione di una galleria di snapshot di quelle regioni dell’immagine, individuate in fase di processing, che sono state identificate come cellule da parte del classificatore neurale. Questa galleria consente un controllo finale interattivo all’operatore, che ha così modo di confermare le risposte corrette fornite dal classificatore o, viceversa, correggerle nel caso in cui esse siano sbagliate.
Come ulteriore prova, è stata testata la funzionalità del software con un’immagine fantoccio contenente tutti i tipi cellulari presenti in un vetrino, al fine di valutare il comportamento complessivo dell’intera architettura.
Con il software implementato si riescono, dunque, ad analizzare molte immagini al minuto, consentendo la classificazione di un gran numero di cellule in modo molto semplice, ripetibile e soprattutto nel minor tempo possibile, superando tutte le limitazioni relative all’esecuzione manuale del test del micronucleo.