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Fra le recenti terapie antivirali attualmente in studio, una particolare attenzione è stata volta negli ultimi anni allo sviluppo di peptidi derivati dai domini N- o C-terminali derivati dalla proteina transmembrana (TM) dell’envelope virale (Env). Questi peptidi, oltre a essere utilizzati per bloccare la fusione e l’entrata del virus all’interno della cellula bersaglio nella fase iniziale dell’infezione, se opportunamente veicolati possono essere utilizzati come immunogeni per indurre una risposta immunitaria di tipo umorale neutralizzante. Questi peptidi sono dunque valutati per il loro potenziale terapeutico o di profilassi. Nel virus dell’immunodeficienza felina (FIV) è stato individuato un piccolo peptide di 8 aminoacidi, denominato C-8, contenente un motivo ricco in triptofani (Trp) che esercita un potente effetto antivirale su tutti gli isolati testati. Inoltre, se compreso in una regione più estesa di 44 mer (ETrp44) è capace di evocare la produzione di anticorpi neutralizzanti. Da studi strutturali e considerato l’elevato grado di conservazione tra i lentivirus, è stato ipotizzato che questo motivo Trp eserciti un ruolo essenziale per l’entrata del virus nella cellula e che sia uno degli epitopi criptici normalmente celati dal virus e contro i quali è difficile indurre anticorpi neutralizzanti.
FIV presenta notevoli similarità strutturali e patogenetiche con il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) ed è quindi considerato un valido modello per lo sviluppo di vaccini e farmaci antilentivirali.
Obbiettivo di questo lavoro è la produzione di un vettore derivato dal Foamy-Virus felino (FFV) per la veicolazione in vivo del peptide ETrp44. Questa strategia offre alcuni importanti vantaggi: i FV non sono patogeni negli ospiti infettati nonostante l’alta prevalenza riscontrata in natura e hanno un ampio tropismo cellulare permettendo l’espressione e il rilascio del transgene in diversi tessuti. Inoltre, rispetto all’immunizzazione con il solo peptide che richiede alte dosi e ripetute somministrazioni, i vettori FFV prodotti allo scopo sono replicazione competenti garantendo così l’espressione continua nel tempo dell’immunogeno. Scopo di questo lavoro di tesi è la caratterizzazione in vitro del costrutto vettore FFV ricombinante per valutare stabilità, capacità di replicazione e i livelli di espressione del peptide.
Il costrutto (pCF-7DU3) è stato realizzato a partire dal clone FFV wild-type per sostituzione della regione U3 dell’LTR in 5’ col promotore del citomegalovirus e inserimento della sequenza codificante ETrp44 nel multiple cloning site ed in frame con il gene bet. Quest’ultimo è un gene regolatorio ed è importante per l’infettività del virus. Per valutare stabilità e competenza per replicazione è stato utilizzato il vettore contenente il gene reporter Green Fluorescence Protein (GFP) fuso al gene bet. Fra le sequenze codificanti di bet e quelle della GFP e del 44mer è stato inserito un linker che contiene un sito di taglio per una proteasi cellulare che consente il rilascio della proteina dalla cellula infettata. L’espressione dei costrutti con GFP e ETrp44 è stata confrontata in parallelo col costrutto wild-type. I costrutti sono stati trasfettati su cellule feline (CrFK) e il virus rilasciato nel surnatante è stato propagato serialmente in CrFK. Dall’analisi delle cellule infettate tramite western-blot e citometria a flusso del costrutto con GFP e del surnatante tramite saggi di infettività b-Gal è risultato che il costrutto Bet-GFP tende a subire riarrangiamenti con delezioni o perdita dell’intera GFP a causa probabilmente della sua grossa dimensione. ETrp44 si è invece dimostrato stabile ed esprime il peptide per periodi protratti. E’ in fase di valutazione il rilascio del peptide nel surnatante di coltura. La caratterizzazione in vitro costituirà premessa indispensabile alla successiva analisi in vivo nella quale si valuterà l’efficacia del vettore FFV/ETrp44 come possibile vaccino anti-FIV.