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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-05112017-002005


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
MENCHINI, MARTINA
URN
etd-05112017-002005
Titolo
Valutazione degli effetti di un estratto acquoso di Kavolì® nei confronti di steatosi epatica.
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Longo, Vincenzo
relatore Pozzo, Luisa
Parole chiave
  • NAFLD
  • nutraceutico
Data inizio appello
29/05/2017
Consultabilità
Completa
Riassunto
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) rappresenta una patologia epatica in aumento nei paesi sviluppati. La NAFLD è una delle cause più frequenti di alterazione delle funzioni del fegato ed è caratterizzata dall’infiltrazione di trigliceridi negli epatociti. Queste patologie si possono manifestare come semplice steatosi (con accumulo di lipidi negli epatociti) o steatoepatite non alcolica (NASH), caratterizzata da un aumento di infiammazione, fibrosi, stress ossidativo e un marcato danno epatico. L’accumulo di lipidi nel fegato e lo sviluppo di NAFLD sembra essere correlato allo stile di vita, all’alimentazione, all’obesità, ma anche alla presenza di alcune malattie metaboliche come il diabete.
Gli studi che correlano l’assunzione di alimenti di origine vegetale e lo stato di salute degli individui hanno assunto sempre maggior importanza negli ultimi anni. Oggetto di alcune di queste ricerche sono le piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae. Nella presente tesi sono stati valutati i possibili effetti protettivi e anti-steatotici del Kavolì®, una Brassica oleraceavar.acephala prodotta grazie a particolari tecniche agronomiche e raccolta ad uno stadio giovane, in ratti con steatosi non alcolica (NAFLD).
Sono stati valutati inoltre alcuni parametri di stress ossidativo nell’encefalo e nel colon poiché, secondo recenti studi, la dieta potrebbe influenzare non solo l’asse intestino-fegato, ma anche il sistema nervoso centrale.
Al fine di sviluppare un modello di steatosi umana, in presenza di diabete, nei ratti, è stato messo a punto un protocollo che combina una dieta iperlipidica, che causa insulino resistenza, con streptozotocina, che inibisce la funzione delle cellule β del pancreas favorendo l’iperglicemia.
Venti ratti maschi Wistar sono stati divisi in due gruppi: uno di controllo (CTR, n=5) alimentato con dieta standard (11% di energia derivante da grassi) e un altro alimentato con dieta iperlipidica (55% di energia derivante da grassi, 2% colesterolo). Quest’ultimo gruppo è stato trattato con una dose di streptozotocina (40 mg/kg p.v.), che induce apoptosi le cellule β del pancreas e conseguente sviluppo del diabete, dopo un mese di dieta iperlipidica. I ratti che hanno sviluppato iperglicemia (>250 mg/dl) sono stati ulteriormente suddivisi in due gruppi: uno che ha continuato a ricevere esclusivamente dieta iperlipidica (DIPL, n=8) e l’altro al quale sono stati somministrati contemporaneamente dieta iperlipidica e un estratto acquoso di Kavolì® (1g/kg p.v.) (DIPL+KAV, n=7) per 6 settimane. Al termine dell’esperimento gli animali sono stati sacrificati prelevando campioni di sangue, fegato, encefalo e intestino (colon).
Sono stati quindi analizzati i diversi effetti attraverso la misurazione dei parametri ematici, la determinazione di alcune attività degli enzimi del drug-metabolism e la quantificazione del contenuto lipidico epatico. Per quanto riguarda i parametri ematici, le concentrazioni di colesterolo totale, glicemia, trigliceridi, bilirubina, ALT e AST sono significativamente aumentati nei ratti alimentati con dieta iperlipidica rispetto ai ratti di controllo, inoltre negli animali trattati con Kavolì® i valori delle ALT sono significativamente diminuiti. I livelli di insulina sono significativamente diminuiti nel gruppo dei DIPL rispetto al controllo così come nel gruppo dei ratti sottoposti a trattamento con Kavolì®. La presenza di steatosi è stata verificata attraverso la quantificazione dei lipidi nel tessuto epatico, che è risultata marcatamente aumentata nei ratti trattati con dieta iperlipidica e significativamente ridotta nei ratti trattati con Kavolì®.
Sono state determinate le attività marcatrici del CYP2E1 (anilina idrossilasi e p-nitrofenolo idrossilasi) le quali sono aumentate significativamente nel gruppo DIPL rispetto al controllo; non c’è stato però un ripristino dei valori nel gruppo DIPL+KAV.
È stata determinata anche l’attività dell’ECOD, marcatrice del citocromo totale, la quale risulta indotta nel gruppo DIPL e DIPL+KAV.
Il dosaggio del glutatione nel fegato, encefalo e colon non mostra differenze significative.
La quantità di proteine carbonilate nel fegato ed encefalo è risultata significativamente maggiore nel gruppo dei ratti trattati con dieta iperlipidica e significativamente ridotta nel gruppo DIPL+KAV rispetto al gruppo DIPL e lo stesso andamento è mostrato per i valori di MDA in entrambi gli organi.
È stata effettuata l’analisi istologica mediante la colorazione ematossilina-eosina, sui campioni di fegato la quale ha confermato la presenza di steatosi ed ha evidenziato la presenza di infiltrato infiammatorio nel gruppo DIPL.Nel gruppo DIPL+KAV sembra esserci un miglioramento soprattutto riguardo alla presenza di infiammazione.
Mediante real time PCR è stata analizzata l’espressione genica di TNF-α e IL-6. Queste citochine pro-infiammatorie mostrano livelli di mRNA maggiori nel gruppo DIPL e i valori si riducono nel gruppo trattato con l’estratto di Kavolì® (in modo significativo solo per TNF-α). Inoltre è stata analizzata l’espressione dei geni dell’eme ossigenasi-1 e DT-diaforasi. I livelli di espressione genica dell’emeossigenasi-1 mostrano un aumento nel gruppo DIPL e una diminuizione nel gruppo DIPL+KAV. L’espressione genica della DT-diaforasi non mostra differenze significative tra vari gruppi. Per questi ultimi due enzimi è stata valutata anche l’attività che mostra un andamento simile all’espressione genica. L’emeossigenasi-1 risulta indotta in modo significativo nei DIPL e la sua attività si riduce significativamente nel gruppo DIPL+KAV. I valori dell’attività della DT-diaforasi non mostrano variazioni significative.
La somministrazione del Kavolì® (1g/kg p.v.) ha diminuito il contenuto lipidico epatico, migliorado la steatosi. Inoltre, ha mostrato un effetto antiossidante ed antinfiammatorio a livello del fegato, migliorando i livelli di stress ossidativo, e diminuendo la presenza di infiltrato infiammatorio e l’espressione genica delle citochine infiammatorie. Infine anche a livello encefalico l’estratto acquoso di Kavolì® ha dimostrato migliorare i livelli di stress ossidativo.

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is one of the most common chronic liver disorders worldwide. NAFLD is mainly characterized by an accumulation of lipids in the liver.
This pathology covers a wide range of changes in the liver, ranging from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Metabolic disorders, such as lipid accumulation, insulin resistance, and inflammation, have been implicated in the pathogenesis of NAFLD, but the underlying mechanisms, including those that drive the progression of the disease, are not fully understood.
The lipid accumulation in the liver seems to be related to lifestyle, nutrition, obesity but also to the presence of other metabolic diseases such as diabetes.
The aim of this study was to discusse the antisteatotic and protective effect of Kavolì®, a Brassica oleracea var. Acephala, in rats with fatty liver disease.
In order to model the development and metabolic characteristics of human steatosis in the presence of diabetes in rats, a protocol was developed which combines a high fat diet (HFD) with a low dose of streptozotocin (40 mg/kg b.w.) that causes diabetes inducing a partial β-cells apoptosis.
Some parameters of oxidative stress in the brain and colon was also evaluated because, according to recent studies, the diet may affect not only the gut-liver axis but also the central nervous system.
Twenty Wistar rats were treated for 10 weeks. During the first four weeks the rats were divided into two groups: the control group (CTR, n=5) fed with standard diet (11% of energy from fats) and the high fat group fed with high fat diet (55% of energy from fat, 2% of cholesterol). After one month the second group was injected with a low dose of streptozotocin (40 mg/kg). The rats with hyperglycemia(glucose concentration > 250 mg/dl) were divided into two groups: one treated with only high fat diet (DIPL, n=8) and the other fed with high fat diet and an aqueous extract of Kavolì® (1g/kg b.w.) by gavage (DIPL+KAV, n=7).
ALT, AST, cholesterol, glucose, triglycerides, were measured on blood samples and resulted increased in DIPL and DIPL+KAV group. Only the ALT values were decreased in DIPL+KAV group. The level of blood insulin was also evaluated and was resulted decreased in DIPL and DIPL+KAV group.
Hepatic lipid quantification showed the presence of steatosis in DIPL group and this lipid content significantly decreased in DIPL+KAV. Histological analyses (hematoxylin-eosin stain) were performed in liver samples showing the presence of steatosis and inflammationin DIPL group. The presence of inflammation seems decrease in the DIPL+KAV group. Expression of genes involved in inflammatory response (TNF-α and IL-6) were analyzed in liver samples by real-time PCR. The values of TNF-α increased in DIPL group and decreased significantly in DIPL+KAV group.
A significant rise in ECOD activity and in markers of CYP2E1 was observed in DIPL group. The aqueous extract of Kavolì® did not seem to have any effect on these activities.
Glutathione content, lipid peroxidation and protein carbonilation were measured in liver, encephalus and colon samples. Glutathione content did not show significant variations. Lipid peroxidation and protein carbonilation showed a rise in DIPL group and a significantly reduction in DIPL+KAV group, in both brain and liver. Oxidative stress parameters did not show significant variations in colon samples.
Heme oxygenase-1 activity and antioxidant activity of DT-diaphorase were measured on liver samples. Heme oxygenase-1 activity resulted significantly increased in DIPL group and decresed in DIPL+KAV. DT-diaphorase activity did not show significant variations.
In conclusion, the aqueous extract of Kavolì® improved the hepatic steatosis and showed an antioxidant and anti-inflammatory activity in the liver and brain.
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