• sviluppo del sistema nervoso centrale
• topi "knockout"
• fibre muscoidi
• Hoxa2
• sistema precerebellare
• rombencefalo

I geni Hox costituiscono una famiglia di fattori di trascrizione contenenti omeodominio, omologhi ai geni selettori omeotici di Drosophila e che si ritrovano espressi durante lo sviluppo embrionale. La combinazione dell’espressione di distinti geni Hox all’interno di ciascun segmento genera uno specifico codice Hox in grado di conferire un preciso valore posizionale lungo l’asse antero-posteriore (A/P). Nei vertebrati il ruolo di questi geni è stato studiato prevalentemente nel topo, in quanto questo modello ha reso possibile inattivare specifici membri della famiglia Hox attraverso l’impiego delle tecniche di “knockout” genico. Alcuni di essi specificano l’identità morfogenetica della parte posteriore dell’encefalo embrionale, il rombencefalo. A stadi precoci di sviluppo questa regione è transitoriamente segmentata lungo il suo asse A/P in una serie di compartimenti denominati rombomeri (r). Ciascun rombomero presenta distinte proprietà di adesione cellulare e specifiche caratteristiche molecolari fondamentali per la generazione delle diverse popolazioni neuronali che si svilupperanno in questa porzione del sistema nervoso centrale (SNC). Nonostante il ruolo dei geni Hox sia stato classicamente associato al controllo di eventi dello sviluppo embrionale precoce, recentemente è emersa l’ipotesi che alcuni di questi possano avere un ruolo in eventi tardivi dello sviluppo embrionale o, addirittura, a stadi post-natali.
Hoxa2 è, tra i membri di questa famiglia, quello che presenta il dominio di espressione più rostrale, con il margine anteriore in corrispondenza del confine tra i rombomeri 1 e 2 (r1/r2). Il “knockout” di Hoxa2 ha mostrato che questo gene è necessario per il normale sviluppo del rombencefalo anteriore ed in particolare per la corretta specificazione di alcuni tipi neuronali che differenziano in r2 ed r3, come ad esempio i neuroni del nucleo cocleare.
Risultati ottenuti nel nostro laboratorio hanno mostrato che nel topo il “knockout” di Hoxa2 provoca severe anomalie a carico dello sviluppo del nucleo pontino caratterizzate principalmente da un’espansione in senso rostro-caudale del nucleo stesso. Questo costituisce, insieme ad altri cinque nuclei troncoencefalici, il sistema precerebellare che media la maggior parte delle afferenze al cervelletto necessarie per coordinare l’attività motoria. Il nucleo pontino si forma durante una finestra temporale compresa tra 16 giorni di gestazione (E16) e la nascita (P0) nella regione ventrale del ponte che deriva dai rombomeri 2 e 3 a partire da precursori precedentemente generati nella porzione dorsale del ponte. A stadio E18.5, circa un giorno prima della nascita, inizia la formazione dei processi assonali dei neuroni del nucleo pontino diretti allo strato granulare del cervelletto. Lo sviluppo di queste proiezioni, porta alla formazione delle fibre muscoidi e si protrae per alcuni giorni dopo la nascita. Il nucleo pontino risulta quindi un ottimo modello sperimentale per studiare il potenziale ruolo tardivo di Hoxa2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. A rafforzare questa possibilità contribuiscono dati preliminari che hanno evidenziato in una linea “knockin” Hoxa2/EGFP la presenza di fluorescenza dovuta all’espressione del gene “reporter” a livello del nucleo pontino fino a stadi perinatali.
Prerogativa per un possibile ruolo di Hoxa2 nel controllo della generazione della fibre muscoidi è la presenza della sua espressione nei neuroni del nucleo pontino. Per questo motivo durante la prima fase del mio internato di tesi ho analizzato il “pattern” di espressione post-natale di Hoxa2. A tale proposito ho effettuato esperimenti di ibridazione in situ radioattiva utilizzando una sonda specifica contro Hoxa2 marcata con 35S su sezioni di topo a stadio P0.5. I risultati ottenuti hanno mostrato per la prima volta che l’mRNA di Hoxa2 è espresso in maniera specifica dai neuroni del nucleo pontino. Successivamente, per analizzare lo sviluppo delle fibre muscoidi ho effettuato esperimenti di marcatura retrograda su preparati di encefalo ottenuti da animali eterozigoti e mutanti per Hoxa2 a stadio P0.5. L’applicazione di un composto lipofilico fluorescente (DiI) a livello della regione del nucleo pontino ha permesso di visualizzare le proiezioni assonali al cervelletto e ha messo in evidenza una chiara disorganizzazione e defascicolazione a carico di queste fibre negli animali Hoxa2-/-. Nel mutante inoltre i neuroni del nucleo pontino proiettano in maniera anomala al cervelletto intraprendendo vie di migrazione diverse da quelle osservate negli embrioni di controllo. Inoltre, l’impiego di una linea “knockin” Hoxa2/tau-LacZ, in cui la regione codificante del gene Hoxa2 è stata sostituita con quella del gene “reporter” LacZ coniugato ad un segnale di localizzazione assonale (tau), ha permesso di caratterizzare ulteriormente la natura del fenotipo a carico delle fibre muscoidi. L’analisi molecolare, mediante ibridazione in situ su sezione, utilizzando come marcatori geni noti per essere coinvolti nel controllo della formazione delle proiezioni assonali, ha messo in evidenza una alterata espressione di alcuni di questi marcatori a livello dei neuroni del nucleo pontino. Infine, è stata effettuata l’analisi della formazione delle fibre muscoidi su encefali ottenuti da animali mutanti condizionali per Hoxa2 con due distinti genotipi in cui l’espressione di Hoxa2 è selettivamente eliminata nei territori in cui migrano le fibre muscoidi (r2) o nei neuroni del nucleo pontino. Nei campioni con il secondo genotipo condizionale è stato possibile osservare alterazioni a carico dello sviluppo delle fibre muscoidi simili a quelle osservate negli animali mutanti totali per Hoxa2.
Con il mio lavoro di tesi è stato possibile dimostrare che Hoxa2 è espresso a stadi post-natali nel sistema nervoso centrale e che la sua assenza provoca anomalie a carico della formazione delle fibre muscoidi. Questi dati per la prima volta dimostrano che il gene Hoxa2 svolge un ruolo in eventi tardivi durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale del topo, intervenendo nei meccanismi che controllano la proiezione assonale.