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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-05092016-133054


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
LONGO, ALESSIA
URN
etd-05092016-133054
Titolo
DEVELOPMENT OF ELECTROCHEMICAL BIOMEMS FOR TNFalpha DETECTION IN SALIVA: APPLICATION TO HEART FAILURE.
Dipartimento
INGEGNERIA DELL'INFORMAZIONE
Corso di studi
INGEGNERIA BIOMEDICA
Relatori
relatore Prof.ssa Menciassi, Arianna
tutor Dott.ssa Vatteroni, Monica
relatore Prof. Errachid El Salhi, Abdelhamid
tutor Dott. Baraket, Abdoullatif
Parole chiave
  • BioMEMs
  • rilevazione TNFalpha
  • sensibilità
  • interferenza
  • saliva
Data inizio appello
10/06/2016
Consultabilità
Completa
Riassunto
- Introduzione.
Il lavoro svolto durante questo periodo è stato focalizzato su un sensore anche detto BioMEMS (Biological Micro Electro Mechanical Systems) con substrato in silicio (SI). Si tratta di un dispositivo che presenta 8 elettrodi di lavoro, un contro elettrodo ed un elettrodo di riferimento.
Lo scopo del lavoro svolto è stato dimostrare e verificare che il dispositivo utilizzato sia un dispositivo sensibile, selettivo e che le misure siano ripetibili. La superficie del BioMEMS è stata biofunzionalizzata e caratterizzata in modo selettivo per la molecola TNFa (Tumor Necrosis Factor). Ci si è concentrati soprattutto sul TNFa, poiché è stato visto che questa molecola svolge un importate ruolo nelle malattie di tipo cardiaco ed, inoltre, è presente nella saliva, sia perché prodotta dalle ghiandole salivari sia grazie ai continui scambi tra saliva e plasma. Per cui, si pensa che un’ elevata presenza di molecole TNFa nella saliva, possa fungere da campanello d’allarme per malattie di tipo cardiovascolare.
La superficie degli elettrodi del BioMEMS è stata prima biofunzionalizzata per il TNFa usando una tecnica di tipo elettrochimico, nota come Voltammetria Ciclica (CV) ed, in seguito, il dispositivo è stato sottoposto sia a rilevazione ottica, effettuata mediante microscopio ottico, che a rilevazione elettrochimica mediante la Spettroscopia ad Impedenza Elettrochimica (EIS).
Normalmente, nella maggior parte dei laboratori la superficie degli elettrodi è trattata utilizzando tecniche più complesse, come ad esempio ELISA. Purtroppo, queste tecniche richiedono personale altamente qualificato, prevedono l’uso di coppie di anticorpi, procedure di lavaggio complicate, sono costose e richiedono molto tempo.
Per tutti questi motivi, immunosensori elettrochimici basati sulla Spettroscopia ad Impedenza Elettrochimica (EIS) hanno recentemente ottenuto molta attenzione nel campo dello sviluppo dei biosensori. L’EIS è una tecnica utilizzata per studiare la risposta di sistemi ai quali viene applicato un piccolo segnale periodico a frequenze diverse. Tale tecnica è molto interessante per lo studio di biosensori, in quanto si tratta di un metodo non distruttivo che fornisce dati di alta qualità convertendo direttamente un evento biologico in segnale elettrico.

- Biofunzionalizzazione della superficie degli elettrodi.
Il primo passo è stato funzionalizzare la superficie degli elettrodi del biosensore, effettuando la deposizione di uno strato di CMA (4-carboxymethylaniline) sull’elettrodo d’oro nudo, tramite CV, così da bloccare la superficie dell’elettrodo. Dopo aver effettuato la deposizione di CMA, il dispositivo è stato incubato in una soluzione contenente EDC/NHS (N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethyl-carbodiimide hydrochloride, EDC; N-hydroxysuccinimide, NHS), per un ora a temperatura ambiente, così da garantire un legame stabile tra anticorpi e superficie dell’elettrodo di lavoro. Al termine il biosensore è stato sottoposto a dei lavaggi con HCl (0,1 M), in modo da rimuovere l’eccesso di EDC/NHS, ed è stato successivamente incubato in una soluzione contente 20 microL di anticorpi TNFa più 980microL di PBS (phosphatebuffered saline) a 4°C per 1 ora. Terminato il periodo di incubazione con gli anticorpi, il sensore viene, infine, nuovamente incubato in una soluzione contente 1 microL di Ethanolamine più 999 microL di PBS, per 20 minuti a temperatura ambiente, questo, per eliminare l’eccesso di gruppi COOH formatisi in seguito alla deposizione di CMA.
A questo punto, la superficie dell’elettrodo è stata biofunzionalizzata per il TNFa.

- Sandwich di anticorpi: rilevazione ottica.
Per verificare se gli anticorpi si sono legati al substrato e per dimostrare l’effettivo legame antigene/anticorpo specifico, è stato realizzato il cosiddetto Sandwich di anticorpi, formato da: anticorpo primario, antigene ed anticorpo secondario con fluorescenza. Il sensore è stato, dunque, caratterizzato in modo ottico.
Per ottenere il sandwich di anticorpi, dopo aver funzionalizzato la superficie per il TNFa, il sensore è stato incubato per 30 minuti con l’antigene TNFa, a 4°C. Al termine di tale incubazione, per avere anche i dati di tipo elettrochimico, è stata misurata l’impedenza elettrochimica.
Infine, l’ultimo processo per la formazione del sandwich di anticorpi, consiste nell’incubare il dispositivo in differenti concentrazione di anticorpi secondari presentatnto fluorescenza: 1 pg/mL, 25 pg/mL, 2,5 ng/ml e 0,25 microg/ml. Naturalmente, si è partiti dalla concentrazione minore per arrivare alla concentrazione maggiore, in modo da non saturare subito tutti i complessi anticorpo primario/antigene.
La caratterizzazione ottica è stata effettuata utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Grazie alla caratterizzazione di tipo ottico si è potuto confermare la formazione del sandwich di anticorpi, che comporta, di conseguenza, una corretta biofunzionalizzazione della superficie dell’elettrodo e un corretto legame tra anticorpo e antigene. Cosa che, come ci si aspettava, non è avvenuta nell’elettrodo la cui superficie non è stata funzionalizzata e che non presenta alcuna fluorescenza.
La formazione del sandwich di anticorpi è stata confermata, oltre che con metodo ottico, anche tramite metodo elettrochimico.

- Prove di rilevazione ed interferenza.
Dopo aver verificato la corretta caratterizzazione della superficie dell’elettrodo e la corretta formazione del complesso anticorpo/antigene, sono stati svolti numerosi esperimenti per determinare il legame dell’anticorpo TNFa al suo antigene specifico, ciò è stato fatto per dimostrare la selettività del BioMEMS, in seguito alla biofunzionalizzazione della superficie dei suoi elettrodi di lavoro per una molecola specifica, in questo caso per il TNFa, e per verificare la ripetibilità delle misure.
Il sensore è stato , dunque, incubato, conseguentemente alla funzionalizzazione della superficie con anticorpi TNFa, in differenti concentrazioni di antigene TNFa : 1 pg/mL, 5pg/mL, 10 pg/mL, 15 pg/mL.
Dal grafico EIS si evince che l’antigene si è legato al suo specifico anticorpo. Questo tipo di esperimento è stato ripetuto più volte dando sempre esito positivo alla formazione del complesso anticorpo/antigene, confermando, dunque, la ripetibilità di tale procedura.
Per verificare la sensibilità e la selettività del biosensore nei confronti del TNFa, dopo essere stato funzionalizzato con anticorpi TNFa, è stato incubato con altre tipologie di antigene. Gli altri antigeni utilizzati sono stati: IL1, IL8 e IL10; questi ultimi non si sono legati alla superficie del dispositivo dimostrando, dunque, un elevata selettività del biosensore.
Infine, al termine degli esperimenti, per ogni curva EIS relativa ad ciascun elettrodo del BioMEMS, è stata effettuata l’analisi dei dati mediante un fitting tramite software EC-Lab.
Grazie all’analisi dei dati siamo stati in grado di ricavare la curva di sensibilità del BioMEMS nei confronti degli antigeni studiati: TNFa, IL-1, IL-8, IL-10.
Da tale grafico è stato possibile confermare un elevata sensibilità del biosensore per l’antigene TNFa, rispetto gli altri antigeni. Dunque, il dispositivo funzionalizzato per il TNFa si è dimostrato altamente specifico per questo.

- Rilevazione in un mezzo fisiologico.
Lo stesso studio è stato applicato utilizzando un medium fisiologico. In primo luogo si è osservato il comportamento dei BioMEMS nei confronti di campioni di saliva reale. Pertanto, i BioMemS, in precedenza biofunzionalizzati con anti-TNFa, sono stati incubati in 1 ml di saliva umana, ciò che si è ottenuto, è stato un elevato aumento della resistenza della superficie dell’elettrodo, in quanto la curva è cresciuta moltissimo ad ogni incubazione.
In questo caso si è avuta un elevata crescita dell’impedenza dell’elettrodo di lavoro dopo ogni incubazione, questa crescita elevata, probabilmente, è dovuta ad effetti di tipo matriciale, cioè alla superficie dell’elettrodo si sono legate anche molecole diverse dal TNFa.
Per cercare di ridurre tali effetti sono stati svolti esperimenti diluendo la saliva umana rispettivamente in PBS e PBS Tween.
Anche in questi altri due casi, lo shift della curva tra un’incubazione e l’altra è molto elevato e, per dimostrare e verificare che questo shift elevato non è dovuto alla sola formazione di complessi AbTNFa/AgTNFa, ma probabilmente all’interazione della superficie biofunzionalizzata dell’elettrodo con molecole diverse dal TNFa, il dispositivo è stato anche incubato nella saliva artificiale. In quest’ultimo caso, come ci si aspettava, non ho avuto rilevazione, la curva nelle incubazioni successive alla prima è rimasta pressoché simile. Pertanto, possiamo affermare che in saliva artificiale non si verificano effetti di tipo matriciale, confermando la piena funzionalità del sensore.
In seguito, in accordo con quanto presente in letteratura, dove viene definita la concentrazione normale di TNFa in saliva umana pari a 67,37 pg/mL, il biosensore è stato incubato nella saliva artificiale, aggiungendo a quest’ultima diverse concentrazioni di antigene TNFa: 40 pg/mL, 50 pg/mL, 60 pg/mL, 70 pg/mL.
Infine, per confermare la presenza di effetti matriciali quando il dispositivo viene incubato nella saliva umana, lo stesso sensore, dopo l’ultima incubazione con la maggiore concentrazione di antigene, è stato incubato per altre tre volte in 1mL di saliva umana; confermando purtroppo la presenza di effetti matriciali.

- Conclusioni.
Il BioMEMS si è rivelato un dispositivo a basso costo, con elevata sensibilità e specificità per il TNFα, ed è stato verificato che la tecnica EIS utilizzata per la rilevazione elettrochimica del biosensore permette di ottenere misure ripetibili.
In questa ricerca viene descritto un metodo altamente sensibile e specifico per la rilevazione del TNFα diluito, sia in PBS che in un mezzo fisiologico. Il biosensore sviluppato è in grado di rilevare TNFα umano, proveniente da campioni diluiti in PBS e in saliva artificiale. Per quanto riguarda le misurazioni di TNFα in campioni di saliva umana, si sono verificati effetti matriciali che purtroppo tendono a falsare le misure.
La ricerca futura potrebbe, dunque, focalizzarsi sul miglioramento biosensore, così da renderlo efficace e selettivo anche per la saliva umana.
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