• acque di balneazione
• Adenovirus
• Norovirus

Le acque adibite ad uso ricreativo possono costituire un’importante veicolo di patologie da agenti infettivi poiché fungono da recettori di reflui di varia natura (scarichi fecali, attività industriali, agricole e zootecniche) che risultano spesso solo parzialmente depurati o privi di trattamenti preventivi.
Tra i microrganismi patogeni che possono essere riversati nelle acque, i virus enterici patogeni stanno assumendo sempre maggiore importanza, anche a seguito del miglioramento delle tecniche di analisi che permettono di attribuire a questi molti episodi epidemici prima classificati come ad eziologia sconosciuta.
La direttiva europea 2006/7/CE sulle acque di balneazione prevede la sola ricerca di batteri indicatori di inquinamento fecale (E.coli ed enterococchi) che, sebbene in grado di rivelare una contaminazione e quindi un rischio indiretto per la salute, non costituiscono parametri correlabili con la presenza di virus enterici, le cui caratteristiche di elevata persistenza ambientale ne hanno permesso il ritrovamento anche in acque con indici batteriologici al di sotto dei limiti di legge.
La frequenza di infezioni virali legate alla balneazione mette in luce la necessità della standardizzazione di tecniche per la ricerca di virus umani come indicatori di qualità delle acque ad uso ricreativo e del rischio per la salute pubblica.
Tra i virus enterici comunemente associati a gastroenteriti troviamo Norovirus e Adenovirus (sierotipi 40 e 41). I Norovirus sono virus a RNA a trasmissione oro-fecale considerati tra i più importanti agenti di infezioni gastrointestinali dovute ad acque ricreative. Gli Adenovirus sono associati a gastroenteriti nelle acque di balneazione, particolarmente nei bambini, e sono causa anche di congiuntiviti e malattie respiratorie; comunemente ritrovati in scarichi fecali che vengono riversati nelle acque di balneazione, si ritrovano in numero elevato nell’ambiente acquatico, inoltre sono virus a DNA molto resistenti nell’ambiente ed ai trattamenti di disinfezione e per questo considerati come candidati ideali al ruolo di indicatore virale di inquinamento fecale.
Lo scopo di questo lavoro è appunto quello di valutare metodi rapidi e poco costosi per il rilevamento di Adenovirus e Norovirus in acque di balneazione, in collaborazione con altri 16 laboratori europei e nell’ambito del progetto europeo “Methods for the concentration and detection of adenoviruses and noroviruses in european bathing waters with reference to the revision of the bathing water directive 76/160/EEC”.
Le tecniche scelte variano per il tipo di filtro (membrana di nitrato di cellulosa o lana di vetro) e per l’eluente utilizzato (skimmed milk o beef extract); per ogni metodica sono state realizzate 10 repliche.
Campioni artificiali di acqua marina e dolce sono stati contaminati con Adenovirus (di tipo 2) e Norovirus (genogruppo 2) a concentrazione nota e sottoposti a filtrazione, successiva eluizione delle particelle virali, ulteriore concentrazione tramite flocculazione, centrifugazione e risospensione in una soluzione salina.
Per valutare l’efficienza di recupero di Adenovirus e Norovirus i concentrati sono stati analizzati sia attraverso metodiche molecolari (QPCR per Adenovirus e MPN-PCR per Norovirus) sia con tecniche colturali che permettono di conteggiare le particelle virali (metodica delle placche di lisi per Adenovirus). Le prove effettuate con acqua dolce hanno mostrato una maggiore efficienza della tecnica che utilizza le Membrane di nitrocellulosa e lo skimmed milk per il recupero di Adenovirus, mentre per Norovirus la lana di vetro con beef extract come eluente ha ottenuto i risultati migliori. I dati per le prove con acqua marina si sono mostrati discordanti: la metodica colturale per Adenovirus e quella molecolare per Norovirus hanno riportato i risultati migliori attraverso la tecnica che utilizza membrane di nitrocelllulosa e skimmed milk, mentre la biologia molecolare per Adenovirus ha riportato una maggiore efficienza di recupero attraverso le colonne in lana di vetro con beef extract come eluente.
In seguito alla valutazione dei risultati ottenuti e tenendo conto dei risultati complessivi degli altri laboratori partecipanti al progetto europeo, è stata scelta per l’acqua marina la metodica che utilizza come matrice adsorbente la membrana di nitrocellulosa e come eluente lo skimmed milk e per l’acqua dolce la metodica delle colonne di lana di vetro con beef extract.
La fase successiva della ricerca ha riguardato l’applicazione della metodica prescelta a campioni di acqua di mare provenienti da due punti di prelievo lungo la costa toscana, allo scopo di sorvegliarne e valutarne la qualità virologica e microbiologica. I due punti di campionamento si trovano rispettivamente a livello della foce del Fiume Morto e della Bocca d’Arno.
I risultati del monitoraggio ambientale hanno evidenziato una generale contaminazione virale: il 23% e il 6% dei campioni è risultato positivo alla RT-PCR rispettivamente per Norovirus genogruppo I e II, mentre la percentuale di positivi alla PCR per Adenovirus è risultata del 24%. Il sequenziamento genico ha permesso di identificare Adenovirus di tipo 41 nel 37,5% dei positivi alla tecnica molecolare.
Gli indicatori batterici e fagici hanno mostrato una scarsa presenza nelle acque monitorate ed una mancanza di correlazione significativa con la presenza di virus, dimostrandosi insufficienti alla valutazione del rischio per le acque che presentano contaminazione virale.