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Tesi etd-05092006-101851


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Neri, Laura
URN
etd-05092006-101851
Title
Struttura e funzione della 5'-nucleotidasi citosolica II (cN-II): studio della glicina 99 attraverso mutagenesi sito-diretta
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
relatore Tozzi, Maria Grazia
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
25/05/2006;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le 5&#39; nucleotidasi sono una famiglia di enzimi estremamente conservati filogeneticamente (si ritrovano sia nei batteri che negli eucarioti più evoluti come i vertebrati) e si differenziano, all&#39;interno della stessa specie, sia per distribuzione tissutale e subcellulare sia per specificità di substrato. La caratteristica comune di questa classe di enzimi è la loro capacità di idrolizzare 5&#39;-deossiribonucleosidi e/o ribonucleosidi monofosfato. Nell&#39;uomo sono state isolate e caratterizzate sette 5&#39;-nucleotidasi: una ancorata esternamente alla membrana citoplasmatica (eN), una mitocondriale (mdN) e cinque citosoliche. <br>Tra le nucleotidasi citosoliche, la 5&#39;-nucleotidasi II (cN-II) è ubiquitaria e idrolizza preferenzialmente IMP, GMP e i loro deossiderivati. Questo enzima, oltre ad avere una attività fosfatasica, possiede anche un’attività fosfotransferasica. Durante l’idrolisi di un nucleoside monofosfato, l’enzima si fosforila e rilascia come primo prodotto, il nucleoside; il fosfato legato all’enzima può essere idrolizzato da una molecola d’acqua oppure può essere trasferito ad un opportuno nucleoside accettore. In vivo è stato dimostrato che la cN-II si comporta come un’idrolasi, mentre resta ancora incerto un eventuale ruolo fisiologico come fosfotransferasi. <br>La cN-II ha una struttura omotetramerica con subunità di 61 kDa e la sua attività enzimatica, dipendente dal magnesio, è modulata allostericamente da specifici effettori (ATP, ADP e 2,3 bisfosfoglicerato) e inibitori (fosfato inorganico).<br>Questa nucleotidasi riveste un importante ruolo nel metabolismo dei nucleotidi purinici; attualmente si ritiene che la sua funzione principale sia quella di controllare la disponibilità intracellulare del precursore purinico IMP, prevenendone la perdita o l’accumulo in funzione delle fluttuazioni della carica energetica. Inoltre è stato ipotizzato che, grazie alla attività fosfotransferasica, la cN-II possa partecipare attivamente alla sintesi de novo del DNA, spiegando così l&#39;aumento della attività enzimatica in tessuti in rapida crescita come il fegato rigenerante di ratto o le cellule tumorali. <br>Nonostante risulti ancora incerto un possibile ruolo fisiologico della cN-II come fosfotransferasi, già da alcuni anni è stata dimostrata la sua capacità di fosforilare alcuni analoghi nucleosidici utilizzati per la cura delle infezioni virali. Inoltre l’attività nucleotidasica della cN-II potrebbe essere implicata anche nell’impedire l’attivazione di alcuni analoghi purinici utilizzati nelle terapie antitumorali e quindi essere responsabile dell’insorgenza di chemioresistenze. L&#39;aumento della sua attività enzimatica in fibroblasti ed emazie di pazienti affetti da sindrome di Lesh-Nyhan, una grave patologia neurodegenerativa, fa pensare ad un coinvolgimento della cN-II in tale sindrome. Studi strutturali e funzionali sulla cN-II risultano perciò importanti per poter perfezionare l’efficacia terapeutica dei farmaci utilizzati in queste patologie.<br>Recentemente è stato dimostrato che, durante la catalisi, la cN-II si fosforila sul primo aspartato della sequenza aminoacidica DMDYT; un motivo aminoacidico simile, il motivo I (DXDX(T/V)), è presente in tutti i membri della superfamiglia delle aloacido dealogenasi (HAD), per questo si ritiene che la cN-II appartenga a tale superfamiglia. Altri motivi strutturali sono presenti sia nella superfamiglia delle HAD che nella cN-II: il motivo II, caratterizzato dalla presenza di un solo aminoacido altamente conservato (Thr o Ser), ritenuto in grado di stabilizzare il substrato formando un legame a idrogeno; il motivo III, costituito da una lisina coinvolta nella stabilizzazione dell&#39;intermedio covalente; il motivo IV, costituito da due residui di aspartato carichi negativamente coinvolti nella coordinazione dello ione Mg2+.<br>Nonostante la bassa omologia di sequenza, i componenti della superfamiglia delle HAD condividono una stessa struttura tridimensionale formata da un core domain in cui è localizzato il sito attivo, costituito da quattro loops che contengono i motivi consenso sovracitati. <br>Alcuni membri della superfamiglia delle HAD presentano un secondo dominio per il riconoscimento del substrato, denominato cap domain, che agisce come un cappuccio sopra il sito catalitico. La natura e la localizzazione del cap domain divide la superfamiglia delle HAD in tre sottogruppi: 1) un sottogruppo con un piccolo cap domain formato da più a-eliche localizzato tra il loop 1 e 2 del core domain; 2) un sottogruppo con un &amp;#946;-sandwich domain tra il loop 2 e 3; 3) un sottogruppo privo del cap domain. Il cap domain è connesso al core domain e muovendosi come un corpo rigido legato ad un perno apre e chiude il sito catalitico al solvente. <br>Nel mio lavoro di tesi ho voluto valutare la presenza e l&#39;eventuale localizzazione del cap domain nella cN-II. È stato ipotizzato che la glicina 99 possa essere la migliore candidata nel conferire flessibilità al cap domain, perciò, per indagare sul ruolo della Gly99, sono stati creati tre mutanti sito-specifici: G99A, G99V e G99P, nei quali la glicina 99 è stata sostituita rispettivamente con Alanina, Valina e Prolina. Tutti e tre i mutanti sono stati sottoposti a dosaggi radioenzimatici per valutare eventuali variazioni dei seguenti parametri cinetici: attività specifica nucleotidasica e PHT, affinità sia per i substrati principali (IMP e Inosina) che per l&#39;attivatore fisiologico ATP e per il catione bivalente Mg2+. Sono state anche calcolate l’efficienze catalitiche (Kcat/Km) ed il rapporto tra l’attività nucleotidasica e l’attività fosfotransferasica. Inoltre, attraverso analisi spettrofluorimetriche in assenza e in presenza di Mg2+, sono andata a valutare l’effetto stabilizzante di questo metallo. I risultati ottenuti hanno evidenziato una variazione dei parametri cinetici dei mutanti rispetto all’enzima wild-type, suggerendo che la glicina 99 entri a far parte dell’architettura del sito attivo.<br>
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