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Nel dicembre 2019, il mondo è stato colpito dalla pandemia da sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus-2 (SARS-CoV-2) causata da un virus a RNA appartenente al genere dei Betacoronavirus. Oltre al virus SARS-CoV-2, le epidemie di virus a RNA degli ultimi anni, tra cui il virus Zika (ZIKV), il virus Ebola ecc., hanno portato l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) a dichiarare questi patogeni come gravi pericoli per la sanità pubblica. Mentre i vaccini e le opzioni terapeutiche contro SARS-CoV-2 sono in continuo aumento, la maggior parte dei virus a RNA non dispone di una terapia approvata dall’OMS.
Negli anni sono stati presi in considerazione come possibili strumenti terapeutici i sistemi CRISPR-Cas. Questi sono stati scoperti nei batteri, dove hanno un ruolo di difesa immunitaria adattativa contro i batteriofagi.
I sistemi CRISPR-Cas sono entrati nella pratica di laboratorio sia per quanto riguarda la ricerca di base, sia per studi mirati che li propongono come possibili strumenti terapeutici per varie malattie, costituendo uno dei sistemi di gene editing e gene silencing più utilizzati.
Nel 2016 è stato identificato il sistema CRISPR-Cas13 che, a differenza del sistema CRISPR-Cas9, presenta una singola subunità in grado di tagliare l’RNA, piuttosto che il DNA.
La Cas13 presenta un meccanismo di azione simile alla Cas9, in quanto anch’essa necessita di una guida a RNA (sgRNA) che una volta associata all’endonucleasi forma il complesso ribonucleoproteico (RNP) e guida l’enzima sull’RNA complementare alla sgRNA. Recenti studi hanno dimostrato, in vitro, che il sistema CRISPR-Cas13d ha una migliore efficienza di degradazione degli RNA bersaglio rispetto all’utilizzo degli RNA interference (RNAi).
Negli ultimi due anni il sistema CRISPR-Cas13d è stato proposto in alcuni studi come possibile strumento per contrastare diversi virus a RNA, tra cui il SARS-CoV-2, e dai primi dati pubblicati si evince che questo enzima ha una notevole attività antivirale.
Questo sistema però, così come tutti i sistemi CRISPR-Cas, presenta un limite importante per quanto riguarda il delivery in vivo: infatti, al momento non esistono sistemi che permettano di fornire in vivo il sistema CRISPR-Cas in maniera sicura ed efficiente.
Una strategia che potrebbe permettere di superare questo limite è l’utilizzo di nanoparticelle d’oro (Au_NPs) che hanno acquisito una grande importanza nel campo della biomedicina grazie alle loro intrinseche proprietà fisico-chimiche che permettono loro di adattarsi perfettamente a diversi usi terapeutici o di imaging presentando, inoltre, un’elevata biocompatibilità.
Il presente progetto di tesi ha come scopo quello di valutare l’effetto terapeutico di una nanoformulazione della Cas13d (Au_NP-X-/Cas13d) su cellule infettate dai virus SARS-CoV-2 e ZIKA.
Il lavoro è iniziato analizzando le sequenze geniche di SARS-CoV-2 e ZIKA e identificando le regioni più conservate tra le varianti. Sono state quindi selezionate e sintetizzate quattro sgRNA per virus. Al fine di selezionare la migliore guida a RNA contro i virus, queste sono state clonate all’interno di un vettore lentivirale crRNA, che esprime la Cas13. Tramite trasduzione con questi vettori della linea cellulare Huh-7, sono state create delle linee cellulari stabili che esprimessero il sistema CRISPR-Cas13 con una sgRNA specifica.
Le linee Huh-7 Cas13-gRNA sono quindi state infettate con SARS-CoV-2 e ZIKA, al fine di valutare la riduzione di infezione rispetto ai controlli, mediante qRT-PCR e microscopia confocale.
Una volta selezionate le sgRNA che riducevano con maggiore efficienza l’infezione da parte dei 2 virus, abbiamo ottimizzato un protocollo di coniugazione dell’enzima Cas13d alle Au-NP-X. Successivamente abbiamo valutato dove queste nanoparticelle localizzassero, con particolare attenzione alle componenti vescicolari della cellula che entrambi i virus sfruttano per replicarsi.
Sorprendentemente, questa nanoformulazione si accumula nei compartimenti vescicolari, massimizzando la possibilità di incontrare i genomi virali durante l’inizio della loro replicazione. Abbiamo quindi fornito le nanoformulazioni direttamente nel mezzo di coltura di cellule Huh-7 infettate con i virus, e valutato la capacità di ridurne la replicazione.
I risultati finora ottenuti evidenziano la capacità della formulazione di entrare in maniera spontanea all’interno delle cellule, di co-localizzare insieme al virus e ridurne la replicazione in maniera significativa.