• phytochelatin synthase
• phytochelatins
• cadmium
• copper
• iron
• ferro
• rame
• cadmio
• fitochelatine
• fitochelatina sintasi
• Marchantia polymorpha

Riassunto
Nel corso dell’evoluzione le piante si sono trovate a vivere in presenza di elementi con caratteristiche chimiche e fisiche diverse, fra i quali alcuni metalli pesanti acquisiti dall’ambiente circostante sono stati selezionati in quanto elementi essenziali per la vita dell’organismo. Con la colonizzazione delle terre emerse le disponibilità di metalli sono aumentate e le piante hanno, quindi, dovuto sviluppare un sistema efficiente per mantenere livelli fisiologici degli ioni e neutralizzarne un eventuale eccesso.
Tra questi sistemi vi sono le fitochelatine (PCn), piccoli peptidi tiolici coinvolti nella chelazione degli ioni metallici presenti nel citosol. I complessi PCn-metallo che si formano possono essere trasportati nel vacuolo, evitando così la libera circolazione degli ioni e riducendone i potenziali effetti tossici dovuti alle interazioni con le molecole biologiche, alle quali risultano particolarmente affini.
La sintesi delle PCn è catalizzata dall’enzima fitochelatina sintasi (PCS), una gamma-glutamilcisteina-dipeptidil-(trans) peptidasi appartenente al “Clan CA” delle cisteina proteasi “papain-like”. Questo enzima è espresso costitutivamente nel regno delle Plantae, in altri organismi eucariotici e persino in alcuni cianobatteri. È stato osservato che la PCS è pressoché ubiquitaria e, laddove presente, si ritiene abbia un’espressione costitutiva.
È stato dimostrato che l’attività dell’enzima risulta correlata alla presenza di alcuni metalli pesanti, come cadmio (Cd), mercurio (Hg), piombo (Pb) e del metalloide arsenico (As). In tempi più recenti è stata però rilevata l’attivazione della PCS nelle briofite e carofite anche in eccesso di micronutrienti metallici, come il rame (Cu) e il ferro (Fe).
Per le ragioni sopra citate, il ruolo dell’enzima potrebbe risultare non direttamente dipendente dalla presenza dei metalli pesanti non essenziali, ma più genericamente correlato alla presenza di concentrazioni tossiche di metalli, essenziali e non. Inoltre, benché sia stato ampiamente dimostrato che la PCS sia fondamentale per la disintossicazione dai metalli pesanti, questo enzima sembra coinvolto anche in altri processi molto diversi, e perciò risulta importante andare a chiarire il ruolo che riveste a livello evolutivo ed i processi fisiologici in cui è coinvolto.
In tale contesto si inserisce questo lavoro di tesi magistrale che si pone l’obbiettivo di indagare gli aspetti molecolari e funzionali dell’enzima PCS e dei suoi prodotti nella risposta ad eccesso di metalli essenziali e non.
Risulta pertanto fondamentale caratterizzare da un punto di vista funzionale l’espressione e l’attività della PCS in organismi basali, la cui collocazione filogenetica è rappresentativa di momenti salienti dell’evoluzione dei vegetali. A tale scopo è stata scelta l’epatica modello Marchantia polymorpha subsp. ruderalis e ne è stata caratterizzata la risposta funzionale in presenza di eccesso di diversi metalli.
È stata valutata la risposta e l’attività della PCS di questa epatica ai metalli Cd, Cu e Fe mediante studi di attività enzimatica in vitro utilizzando l’enzima ricombinante precedentemente purificato.
Colture axeniche in vitro di gametofiti femminili di M. polymorpha sono state allestite per effettuare studi in vivo in presenza di eccesso di Cd, Cu e Fe per diversi tempi di esposizione, al fine di valutare l’espressione e la funzione dell’enzima. Sono state effettuate analisi quali-quantitative in HPLC-ESI-MS-MS al fine di poter caratterizzare i prodotti della reazione catalizzata dall’enzima.
Infine, sono stati valutati i livelli di espressione del gene della PCS tramite PCR quantitativa.
I dati raccolti ed analizzati hanno fornito nuove importanti informazioni sull’enzima PCS il cui ruolo è ancora poco noto in M. polymorpha.


Abstract
During evolution, plants lived in presence of elements with different physical and chemical properties; according to these traits, some heavy metals (which have been acquired from the surrounding environment) have been selected as essential elements for life.
The availability of metals has increased throughout colonization of emerged lands, and plants have developed an efficient system to maintain physiological levels of ions and neutralize their excess.
Among these systems, we can find phytochelatins (PCn), small thiol peptides involved in free metal ions chelation in cytosol. PCn-metal complexes can be transported in the vacuole, to avoid ions free circulation and reduce their potential toxic effects. Damages may occur due to interactions between metal ions and biological molecules, because of their affinity.
Phytochelatins synthesis is catalyzed by the enzyme phytochelatin synthase (PCS), a gamma-glutamylcysteine-dipeptidyl- (trans) peptidase member of the "Clan CA" of the "papain-like" cysteine proteases. This enzyme is constitutively expressed in Plantae realm, in other eukaryotic organisms and even in some cyanobacteria. It has been observed that PCS is almost ubiquitous and it is believed to have a constitutive expression in organism where it has been found.
Phytochelatin synthase activity has been shown to be related to the presence of some heavy metals, such as cadmium (Cd), mercury (Hg), lead (Pb) and the metalloid arsenic (As). Phytochelatin synthase activation has recently been detected even in bryophytes and carophytes, in the presence of excess of metallic micronutrients, such as copper (Cu) and iron (Fe).
Because of that, the role of the enzyme may not be directly dependent on the presence of non-essential heavy metals, while it could be more generally related to the excess of essential and non-essential metals. Although it has been widely demonstrated that PCS is crucial for detoxification from heavy metals, the enzyme appears to be involved also in other processes.
The evolutionary role of PCS and the physiological processes in which it is involved have yet to be investigated.
This work aims to investigate PCS molecular and functional aspects in response to the excess of either essential or non-essential metals.
It is therefore crucial to characterize from a functional point of view the expression and activity of the PCS in basal organisms, whose phylogenetic location is representative of noteworthy moments in plant evolution. For this purpose, the liverwort Marchantia polymorpha subsp. ruderalis was chosen as a model organism and it has been characterized its functional response to the excess of several metals.
It has been characterized the response and the activity of the PCS of this liverwort in the presence of Cd, Cu and Fe by enzymatic activity studies in vitro using the previously purified recombinant enzyme.
Axenic cultures of M. polymorpha female gametophytes have been set up to perform in vivo studies about Cd, Cu and Fe excess at different exposure times, in order to evaluate the expression and function of the enzyme. Qualitative and quantitative analyses were carried out by HPLC-ESI-MS-MS in order to characterize the products of the reaction catalyzed by the enzyme.
Finally, the expression levels of the PCS gene were assessed by quantitative PCR.
Collected and analysed data have provided new important informations about PCS enzyme, whose role in M. polymorpha must be investigated more in depth.