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Tesi etd-05042016-141912


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
PASCALI, FEDERICA
URN
etd-05042016-141912
Title
Determinazione della presenza del virus del tumore mammario umano (HMTV) in una linea di tumore mammario duttale
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Dott.ssa Freer, Giulia
Parole chiave
  • tumore mammario umano
  • HMTV
  • MMTV
  • tumor
  • breast cancer
  • provirus
  • retrovirus
  • cancro al seno
  • virus del tumore mammario murino
  • virus del tumore mammario umano
  • proteine ricombinanti
  • clonaggio
  • anticorpi
Data inizio appello
23/05/2016;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
23/05/2019
Riassunto analitico
Il virus del tumore mammario murino (MMTV), scoperto da Bittner nel 1936, è un retrovirus oncogeno associato al tumore mammario nel topo. La sua trasmissione avviene attraverso l'allattamento, determinando un'alta incidenza del tumore nella progenie, poiché il provirus si può integrare nel genoma murino in prossimità di promotori di famiglie di geni regolatori, alterandone l'espressione. Dati epidemiologici hanno fatto ipotizzare che, tale virus, possa essere coinvolto anche nell’eziologia di alcuni tipi di tumore mammario non familiare nell’uomo. Sono state individuate, in effetti, sequenze virali nel DNA isolato da tumori mammari umani i quali esprimevano anche la proteina virale Env. Nell'uomo, inoltre, sono state identificate sequenze omologhe al gene env di MMTV in biopsie tumorali mammarie, ma non in tessuto mammario normale, facendo ipotizzare l'esistenza di un virus del tumore mammario umano (HMTV). È stato confermato che HMTV ha un’omologia di sequenza nucleotidica del 98% con quella di MMTV.
Lo scopo di questo lavoro è quello di ricercare la presenza del virus HMTV in una coltura primaria di cellule tumorali mammarie risultate positive, in precedenza, al gene env di HMTV, tramite PCR. In una prima fase abbiamo confermato la presenza del DNA virale e la sua integrazione nel genoma cellulare. In secondo luogo, abbiamo cercato di produrre anticorpi monoclonali diretti contro due proteine di MMTV, che potrebbero essere utilizzati per ricercare HMTV in cellule di tumore mammario umano, sfruttando l'omologia tra le due sequenze virali.
La linea che abbiamo studiato è stata in coltura per lungo tempo e, poichè le cellule in esame perdevano progressivamente la positività al virus, sono stati ottenuti dei cloni della linea primaria mediante clonaggio per diluizione limitante.
L'analisi della linea primaria e dei suoi cloni inizialmente è stata condotta con l'intento di confermare la presenza del genoma del virus nel DNA cellulare. Attraverso la tecnica del Southern Blot, utilizzando come sonda una sequenza di 600 bp del gene env di MMTV, si è ricercato il frammento omologo del virus umano inserito nel genoma cellulare. Inoltre, si è amplificato un frammento di 220 bp del gene virale env tramite PCR. Non è stato possibile identificare l'integrazione virale nel genoma cellulare tramite Souther Blot, ma la sua presenza è stata confermata mediante PCR. Questi risultati contraddittori sono probabilmente dovuti alla diversa sensibilità delle due metodiche adoperate.
Per la produzione di anticorpi monoclonali, diretti contro le proteine Env e Gag, è stato effettuato il clonaggio d’espressione delle proteine gp52 e p27 di MMTV. A tale scopo, sono state ottenute le sequenze codificanti per le due proteine dal genoma di topo infettato con MMTV. Le sequenze sono state clonate in un vettore d'espressione che permetteva l'aggiunta di una coda di 6 istidine alle due proteine, che possono così essere rilevate con anticorpi anti-istidina in Western Blot e successivamente purificate per cromatografia di affinità.
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