ETD

Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-05042016-125026


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
DA LIO, DANIELE
URN
etd-05042016-125026
Titolo
Development of a rapid PCR-Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay (PCR-NALFIA) based on rDNA IGS sequence analysis for the detection of Macrophomina phaseolina in soils
Dipartimento
SCIENZE AGRARIE, ALIMENTARI E AGRO-AMBIENTALI
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE VEGETALI E MICROBICHE
Relatori
relatore Dott.ssa Pecchia, Susanna
correlatore Prof.ssa Natali, Lucia
Parole chiave
  • ribosomal DNA
  • marciume carbonioso
  • climate change
  • charcoal rot
  • bead mill
  • soil DNA extraction
Data inizio appello
23/05/2016
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
23/05/2056
Riassunto
Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. is a soil- and seed-borne generalist fungal pathogen that has a global distribution and can infect more than 500 plant species. The fungus produces microsclerotia in root and stem tissues of host plants which enable it to survive in soil for 2–15 years and act as primary source of inoculum. The disease occurrence and severity has been directly related to the population of viable microsclerotia in soil and they are needed for the correct identification of the pathogen.
M. phaseolina distribution is global although it prefers tropical or sub-tropical climates, causing disease in the presence of long periods of drought or with high temperatures. Recent studies predicted its distribution, in the next two decades, in countries where today the fungus does not cause severe losses. In the '80s, in Italy, M. phaseolina initially affected only the sunflower crop. Today, it is also found on other important crops like strawberry, melon, olive and several nursery trees. In light of the above considerations, the development of a rapid and economic diagnostic method to detect the pathogen in infected soils, could be considered an important goal.
The ‘Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay’ (NALFIA) using a generic ‘Lateral Flow Device’ (LFD), combined with PCR employing labelled primers (PCR-NALFIA) to detect a specific amplicon, enables to circumvent the use of electrophoresis, making the diagnostic procedure more rapid and easier. If the specific amplicon is present in the sample, a coloured band, with an intensity proportional to the amplicon concentration, will develop on the LFD strip in addition to the control band. The technique is well established in other research fields like medicine and veterinary diagnostic, food and environment monitoring; the assay was recently applied in plant disease diagnosis, with a few cases limited to plant viruses.
This study describes the development of species-specific primers for M. phaseolina based on the intergenic spacer (IGS) of the rDNA, a high intra- and inter-specific variable genomic region.
The universal primer pair CNL12/CNS1 was used to amplify the whole IGS of M. phaseolina. The resulting fragment of about 3,000 bp, was sequenced in the isolate 10726. Comparing the sequences obtained with those found in GenBank, in the genome projects contigs of seven isolates belonging to the Botryosphaeriaceae, the primer MP891F was developed. The new primer pair MP891F/CNS1 was used to amplify and sequence a ~ 890 bp region in 7 isolates of M. phaseolina. The sequences obtained were analysed to identify a species-specific region (102 bp) and to design two primers, MP102F and MP102R. Their specificity was checked and confirmed using 17 isolates of M. phaseolina and other 16 non-target fungi.
A DNA extraction protocol using different types of soil was also developed. This protocol resulted to be rapid and economic, with a first homogenization step based on a bead-beating technique using silica beads; skimmed milk and PVP were used to prevent PCR inhibitors co-extraction.
The species-specific primers MP102F/MP102R, labelled in 5’ with biotin and FITC respectively, were used in the PCR-NALFIA assay to identify the pathogen starting from mycelium or microsclerotia. Microsclerotia of M. phaseolina (1, 10, 100 and 200) were manipulated and counted under a stereomicroscope and their DNA was extracted using microsclerotia alone or mixed with different types of soil.
The resulting DNA, used for the PCR-NALFIA assay, provided positive results for all the samples tested. A semi-quantitative grey-scale reference card was developed on the basis of the PCR-NALFIA assay using intervals corresponding to microsclerotia soil number. For this purpose, the normalized pixel grey volumes obtained after a densitometric analysis of the test line intensity generated by the LFD strips were used.

Macrophomina phaseolina è un fungo fitopatogeno che attacca oltre 500 specie di piante. Il fungo produce microsclerozi nei tessuti infetti delle piante colpite; queste strutture di resistenza permettono al patogeno di sopravvivere nel terreno per lunghi periodi in assenza di un ospite suscettibile. La sua distribuzione è globale ma predilige i climi tropicali e sub-tropicali, sviluppandosi al verificarsi di periodi di prolungata siccità e temperature elevate. Recenti ricerche hanno previsto che la sua diffusione, nei prossimi due decenni, interesserà anche Paesi in cui, attualmente, non provoca ingenti danni. In Italia, da solo patogeno del girasole negli anni ’80, è oggi individuato su altre piante di interesse agronomico come la fragola, il melone, l’olivo e diverse piante ornamentali e arboree in vivaio. Sulla base di tali considerazioni lo sviluppo di un metodo di diagnosi veloce ed economico per rilevare il patogeno direttamente nel terreno potrebbe risultare un obiettivo importante. La tecnica denominata ‘Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay’ mediante dispositivo LFD (Lateral Flow Device), unita alla PCR con primer marcati (PCR-NALFIA), per il rilevamento di uno specifico amplicone, consente di eliminare il ricorso all’elettroforesi, semplificando e velocizzando la procedura di diagnosi. Se nel campione è presente l’amplicone di interesse sul dispositivo LFD si forma una banda colorata di intensità proporzionale alla sua concentrazione, oltre alla banda di controllo. Questa tecnica è ben consolidata in altri campi di ricerca come la diagnostica medica e veterinaria e la sicurezza alimentare e ambientale; recentemente si sta affermando anche nella diagnostica fitopatologica, con casi limitati alla diagnosi di fitovirus.
Questo studio descrive lo sviluppo di primer specie-specifici per M. phaseolina basati sulla sequenza dello spaziatore intergenico (IGS) dell’rDNA, una regione del genoma caratterizzata da alta variabilità intra e inter-specifica. Utilizzando i primer universali CNL12/CNS1, è stato amplificato l’IGS totale di M. phaseolina. Il frammento, di circa 3000 bp, è stato interamente sequenziato nell’isolato 10726. Confrontando la sequenza ottenuta con quelle individuate in GenBank è stato disegnato il primer MP891F che, utilizzato assieme al primer CNS1, ha consentito di amplificare e sequenziare una regione dell’IGS di circa 890 bp in 7 isolati di M. phaseolina. L’analisi delle sequenze ha permesso l’identificazione di una regione specie-specifica (102 bp) e la costruzione di due primer denominati MP102F e MP102R. La loro specificità è stata saggiata e confermata analizzando 17 isolati di M. phaseolina e 16 isolati fungini non-target. È stato quindi messo a punto un protocollo di estrazione del DNA impiegando tre diversi tipi di terreno agrario. Il protocollo sviluppato è rapido ed economico e prevede una prima fase di omogeneizzazione che fa ricorso alla tecnica bead-beating tramite biglie di vetro e all’utilizzo di latte scremato e PVP per prevenire la co-estrazione di inibitori della PCR. I primer specie-specifici MP102F/MP102R, marcati rispettivamente con biotina e FITC, sono stati impiegati nel saggio PCR-NALFIA per l’identificazione del patogeno partendo da micelio o da microsclerozi. I microsclerozi di M. phaseolina (1, 10, 100 e 200) sono stati manipolati e contati al microscopio stereoscopico e il loro DNA è stato estratto usandoli tal quale o dopo averli addizionati ai diversi tipi di terreno. Il DNA ottenuto, sottoposto al saggio PCR-NALFIA, ha fornito risultati positivi in tutti i campioni saggiati. Sulla base dei risultati del saggio, è stata costruita una carta di riferimento a scala di grigi corrispondenti a intervalli di valori di microsclerozi presenti nel terreno. Per l’analisi è stata utilizzata l’intensità della linea test generata dal dispositivo LFD a seguito di analisi densitometrica.
File