• bioreactor
• scaffold
• tissue engineering

ABSTRACT
Lo sviluppo di farmaci per il trattamento delle patologie oculari necessita di mezzi per verificare la sicurezza delle sostanze usate a contatto con i tessuti bersaglio. La ricerca sta spingendo verso lo sviluppo di soluzioni alternative alla sperimentazione animale, sia per motivi etici sia per motivi pratici ed economici. Questo lavoro di tesi si è incentrato sulla produzione di uno scaffold per l’ingegnerizzazione dello stroma corneale da inserire all’interno di un bioreattore progettato per simulare la struttura anatomica e le funzioni dell’occhio umano. In particolare, è stata realizzata una struttura modulare che riproduce il segmento anteriore dell’occhio. Uno dei moduli può essere aggiunto ad un’altra struttura, sviluppata precedentemente in un altro studio, che mima le caratteristiche ed il funzionamento della retina, appartenente al segmento posteriore dell’occhio, ottenendo così un bioreattore di occhio completo.
Gli scaffold che riproducono lo stroma corneale devono: essere biocompatibili, trasparenti, avere proprietà meccaniche e valori di permeabilità e diffusione simili a quelli del tessuto in vivo, essere porosi ed immagazzinare acqua. Queste specifiche hanno portato, insieme ad una analisi della letteratura, a selezionare i materiali e le tecniche di produzione. A partire dal protocollo proposto nello studio di Tonsomboon et al., sono stati prodotti hydrogel a base di alginato rinforzati con fibre a base di gelatina (GEL) prodotte tramite electrospinning. La produzione degli scaffold ha previsto tre fasi successive: produzione delle membrane, cross-linking delle fibre di gelatina ed infine infiltrazione con alginato e successivo cross-linking di quest’ultimo. Sono state utilizzate tre diverse soluzioni per la produzione delle fibre: GEL/acido acetico-acqua, GEL/acido acetico-acqua/CaCl2, GEL/HFP-acqua/CaCl2. La prima è la soluzione usata nello studio di riferimento, mentre le ultime due sono state scelte per i) eliminare uno step nel protocollo di produzione degli scaffold, ii) ottenere membrane che, se forate, impediscano la fuoriuscita di liquido grazie all’alginato reticolato all’interno della membrana e iii) garantire un legame tra gelatina ed alginato grazie agli ioni Ca2+ presenti all’interno delle fibre. Il cross-linking delle fibre di gelatina è avvenuto utilizzando quattro soluzioni con 25 mM EDC/10 mM NHS, nelle quali è stato modificato il solvente: acqua oppure etanolo/acqua 9:1, 7.3, 5:5 (v/v). Sono stati prodotti anche degli scaffold senza effettuare il processo di cross-linking delle fibre.
Dai test meccanici e dall’analisi qualitativa della trasparenza si è concluso che i campioni ottenuti da membrane GEL/acido acetico-acqua/CaCl2, e successivamente sottoposte a processo di cross-linking dell’alginato, presentano proprietà simili a quelle dei tessuti in soggetti sani, mentre quelli ottenuti da membrane GEL/acido acetico-acqua, cross-linking con soluzione etanolo/acqua 7:3 (v/v) si avvicinano al tessuto stromale in soggetti affetti da glaucoma e ipertensione oculare.
Oltre al lavoro di ricerca riguardante lo scaffold corneale sono stati progettati gli stampi utilizzati per produrre i componenti in PDMS del bioreattore e camere per futuri test di diffusione e permeabilità dello scaffold.

ABSTRACT
Tissue engineering combined with in vitro models provides tools to developing and testing new pharmaceuticals avoiding the use of animals during testing. The aim of this thesis is the development of an in-vitro system able of replicate the human corneal structures and functions. It consists of a 3D corneal stroma scaffold and a bioreactor module which replicates the anterior segment of human eye. The complete bioreactor is obtained by assembling this module with an already existing 3D model of the posterior segment of the eye.
Scaffolds must be biocompatible and biodegradable, their mechanical and optical properties need to be like the cornel native tissue ones and the same goes for permeability values. These design specifications defined the materials and techniques used. Starting from Tonsomboon et al. study, alginate-based hydrogel strengthened by electrospun gelatin (GEL) fibers were produced. The protocol involves three phases: fibers fabrication by electrospinning, gelatin fibers chemical cross-linking by EDC/NHS solution, infiltration by alginate solution (4 wt%) and consequently cross-linking by calcium chloride solution.
Three different solutions were electrospun: GEL/acetic acid-water, GEL/acetic acid-water/CaCl2, GEL/HFP-water/CaCl2. The first one is the same solution used in the reference study, meanwhile the last two solutions were used i) to avoid the step of alginate cross-linking by CaCl2, ii) to produce membranes that if pierced by needle, do not allow water flow away thanks to alginate crosslinked into membrane and iii) to provide ions Ca2+ to link gelatin and alginate.
Gelatin fibers cross-linking is occurred by four different EDC/NHS-based solutions varying solvent type and solvent composition: water, ethanol/water 9:1 v/v, ethanol/water 7:3 v/v, ethanol/water 5:5 v/v. Scaffolds without gelatine fibers cross-linking has also been produced to compare scaffolds integrity.
Mechanical tests and qualitative assessment about transparency lead to the conclusion that the samples, obtained by GEL/acetic acid-water/CaCl2 membranes and consequently alginate cross-linking by CaCl2 solution, can be used to engineer the corneal stroma in healthy subjects; whereas samples obtained by GEL/acetic acid-water membranes and gelatine fibers cross-linking by 25 mM EDC- 10 mM NHS solution with ethanol/water 7:3 (v/v) solvent composition can be used to engineer the corneal stroma in subjects with glaucoma and ocular hypertension.
Besides the corneal scaffold research work, moulds were designed for the fabrication of bioreactor components to insert the scaffold and hold it in position, and a permeability chamber and diffusion chamber for future membranes characterization tests were designed.