• GGT

La GGT è una glicoproteina di membrana di tipo II, costituita da una subunità pesante e una leggera unite da legami non covalenti.
L’enzima è inserito nella membrana cellulare attraverso un dominio transmembrana posto all’estremità N-terminale della catena pesante; il resto della proteina è completamente esposto nell’ambiente extracellulare dove catalizza l’idrolisi del legame glutammico presente nel glutatione, nei suoi coniugati e nel leucotriene C4.
Nei mammiferi la GGT è localizzata nei tessuti epiteliali con attività secretoria e di riassorbimento. Nel fegato adulto in particolare è localizzata sul polo biliare degli epatociti e sulla membrana dei colangiociti ed è secreta nella bile.
Per permettere la separazione delle quattro frazioni di GGT plasmatica è stata messa a punto una procedura nella quale una cromatografia per esclusione molecolare è associata all’iniezione post-colonna di un substrato fluorescente specifico per l’enzima GGT. La cromatografia e le condizioni della reazione post-colonna permettono di individuare e quantificare nel plasma, in modo selettivo e sensibile, quattro frazioni di GGT, delle quali tre sono complessi ad alto peso molecolare dotati, nominati big-GGT (b-GGT; PM=2000 kDa), medium-GGT (m-GGT, PM=1000 kDa), small-GGT (s-GGT, PM=250 kDa) e una quarta frazione, free-GGT (f-GGT, PM=70 kDa) con un peso molecolare compatibile con l’enzima libero.
La frazione f-GGT è la più abbondante nei soggetti sani adulti mente nei pazienti con malattie epatiche si osserva un incremento delle concentrazione delle tre frazioni a più alto peso molecolare (b-, m-, s-GGT). Un primo studio sulla specificità diagnostica della GGT ha dimostrato che i pazienti con steatosi epatica non alcolica e HCV hanno una diversa risposta delle frazioni di GGT, nonostante un valore simile di GGT totale. Tra tutte le frazioni, b-GGT ha una maggiore specificità nei pazienti con steatosi epatica non alcolica, nei soggetti con HCV, b-GGT non mostra variazioni significative, mentre s-GGT è aumentata, suggerendo che il rapporto tra queste due frazioni è un aspetto fondamentale della malattia associata a frazioni di GGT.
Recentemente è stato dimostrato che, nei pazienti infettati da HCV, i valori di GGT totale sono indice negativo di risposta alla terapia con interferone. In questi studi si è potuto notare che bassi livelli di GGT associati ad alti livelli di alanina aminotrasferasi (ALT) sono un importante fattore basale per i soggetti dove si ha una negativizzazione totale della viremia; si è visto che la steatosi, l’obesità e la resistenza all’insulina sono associati con la progressione della fibrosi che può interferire indirettamente con l’effetto dell’interferone sugli epatociti. Per verificare quale frazione si associa al valore prognostico negativo rispetto la terapia, nella seconda parte del mio lavoro ho analizzato un gruppo di pazienti (n=46), messi a disposizione dalla dottoressa Brunetto (primario del reparto di epatologia dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana), affetti da HCV e trattati con peg-interferone e ribavirina. Per ogni paziente è stato ottenuto un prelievo prima dell’inizio del trattamento (T0), dopo un mese dall’inizio della cura (W4) e ventiquattro settimane dopo (W24) la fine della cura in modo tale che non fossero più presenti tracce di farmaci in grado di poter alterare i risultati.
Mediante l’analisi statistica Anova-1 via associata al test di Bonferroni per il confronto multiplo, ho effettuato un confronto delle diverse frazioni della GGT prima durante e dopo il trattamento in pazienti che non rispondono alla terapia (NR), in pazienti dove il virus si riduce ma non si negativizza (PR), in pazienti dove il virus scompare ma ritorna dosabile dopo la fine della terapia (Rel) e infine in pazienti dove il virus si negativizza (SR).
Nei pazienti NR e PR non si riscontrano variazioni significative né della GGT totale né delle frazioni di GGT a nessun tempo. Nei pazienti Rel non si osserva nessun cambiamento nell’arco del primo mesi di terapia, mentre le frazioni bGGT, mGGT ed sGGT risultavano significativamente ridotte al termine della terapia.
Anche nei pazienti SR, che rispondono completamente alla terapia, non si osservano cambiamenti significativi dopo un mese dall’inizio della terapia, mentre sia la GGT totale che le frazioni risultano significativamente ridotte al termine della terapia. In questo gruppo di pazienti, al termine della terapia, si osserva anche un aumento del rapporto b/s ritornando a valori comparabili con i soggetti normali.
Da questi studi possiamo vedere che la GGT-totale è un predittore negativo dalla risposta all’interferone, infatti si può notare che la GGT-totale è uguale nei gruppi NR e PR e maggiore rispetto i gruppi REL e SR.
Se si confrontano i valori di GGT totale e delle frazioni tra i quattro gruppi prima dell’inizio della terapia (T0) si vede che i gruppi mostrano valori di mediana della GGT totale e delle frazioni al di sopra dei valori di riferimento. In particolare NR e PR hanno i valori più alti tra tutti, il rapporto b/s è più basso in tutti i soggetti come riscontrato in una coorte di soggetti infettati da HCV tranne che nei REL. Al W4 non si osservano cambiamenti nei livelli di GGT totale e delle frazioni in nessun gruppo e infine ventiquattro settimane dopo la fine della terapia solo nei gruppi dove si ha negativizzazione della viremia temporanea (REL) o persistente (SR) si osserva un calo della GGT totale e delle frazioni. Nel gruppo SR, il rapporto b/s aumenta in seguito ad un calo della sGGT al termine della terapia, quindi cambia il tipo di s-GGT secreta.
Per descrivere la variabilità del volume di eluizione di s-GGT, invece di utilizzare il volume di eluizione della frazione stessa, ho utilizzato la differenza tra i volumi di eluizione delle frazioni f-GGT e s-GGT [Vel.(f-s)] per minimizzare la variabilità tra le colonne. Ho scelto di utilizzare come riferimento la frazione f-GGT invece di b-GGT perché f-GGT è sempre rappresentata anche nei soggetti sani con bassa attività totale di GGT. Nei quattro gruppi di soggetti trattati con interferone e ribavirina, NR, PR, REL e SR, l’unica differenza significativa si riscontra nel gruppo SR con una diminuzione delle dimensioni di s-GGT tra l’inizio e la fine del trattamento, infatti il picco eluisce più tardi, diminuendo così la distanza tra s-GGT e f-GGT.
Per verificare l’associazione con il danno epatico, ho confrontato l’andamento delle frazioni di GGT e del volume di eluzione di s-GGT con quello dell’alanina-aminotransferasi (ALT), che è il principale indice di danno epatocitario. Quest’ultimo dato non era disponibile per tutti i pazienti ai tre tempi considerati, ma solo per: 10 pazienti su 15 del gruppo NR, 3 su 6 per il gruppo PR,11 su 8 per il gruppo REL, 9 su 7 per il gruppo SR. In questa parte dello studio ho considerato solo i soggetti per i quali erano disponibili tutti i dati e per ragione di numerosità del campione ho raggruppato i pazienti NR e PR.
In tutti i 3 gruppi (NR/PR, REL, SR) si osserva una tendenza alla diminuzione dei livelli di ALT dopo un mese dall’inizio della terapia, anche se nessuno confronto è statisticamente significativo. Alla fine del trattamento nei soggetti non rispondenti (NR/PR) e nei REL i valori di ALT tendono a ritornare al valore iniziale, mentre nei soggetti SR c’è un ulteriore e significativo calo corrispondente alla permanente sospensione della replicazione virale. Successivamente è stata fatta l’analisi di correlazione di Spearman tra i valori di ALT e quelli di GGT totale, delle frazioni, del rapporto b/s e del volume di eluizione di s-GGT , per verificare se questi paramentri sono o meno associati al danno epatocellulare. Dai risultati ottenuti si osserva una correlazione positiva con l’ALT, tranne il rapporto b/s che correla negativamente, quindi all’aumentare di ALT il valore del rapporto diminuisce.
Nello studio successivo abbiamo analizzano dei campioni di pazienti affetti da HCV (n 16), Steatoepatiti (n 10) e Alterazioni dei dotti e microcircolo (n 10).
Il rapporto nel gruppo HCV è il più basso in quanto aumenta prevalentemente s-GGT (associata al danno cellulare), mentre il rapporto aumenta nel gruppo steatoepatite per il prevalente aumento di b-GGT rispetto a s-GGT. Il gruppo con alterazioni dei dotti e microcircolo ha un rapporto intermedio vicino alla mediana dei soggetti di controllo. In quest'ultimo gruppo si osserva che la frazione f-GGT subisce una variazione inferiore rispetto agli altri due gruppi, infatti il valore mediano rimane all'interno dei valori normali dei nostri controlli.
Il confronto dei volumi di eluizione dei picchi corrispondenti alle frazioni di GGT indica che le dimensioni, e quindi la composizione molecolare, di s-GGT cambia, presentando una massa molecolare più grande nel gruppo HCV o con alterazioni dotti/microcircolo che si avvicina alla massa molecolare di mGGT, perciò otteniamo più frequentemente profili di eluizione nei quali i picchi di mGGT e sGGT si fondono. I soggetti con steatoepatite, invece, presentano una forma di s-GGT con massa molecolare minore.