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L’ematopoiesi consiste nella rigenerazione continua delle cellule del sangue che si differenziano a partire da cellule staminali del midollo osseo secondo un processo finemente regolato che richiede l’attivazione di uno specifico pattern di espressione genica. E’ infatti a livello dei fattori di trascrizione che confluiscono le vie di segnalazione cellulare innescate da stimoli di diversa natura, tuttavia molti aspetti di questo programma di sviluppo non sono stati ancora completamente chiariti.
Nel corso degli ultimi anni, un numero crescente di evidenze sperimentali ha indicato i geni contenenti omeobox (omeogeni) come possibili regolatori dell’ematopoiesi. Gli omeogeni codificano fattori di trascrizione, molti dei quali coinvolti nel controllo dello sviluppo di numerosi sistemi cellulari, inclusa la neurogenesi e l’ematopoiesi. Nel nostro laboratorio l’attenzione si è concentrata sull’omeogene Otx1, appartenente alla classe paired e omologo ad Orthodenticle di Drosophila Melanogaster. Esso codifica un fattore di trascrizione contenente un omeodominio di tipo bicoid e risulta cruciale nello sviluppo anatomico e funzionale del cervello e di alcuni organi di senso. La sua inattivazione infatti determina un fenotipo epilettico accompagnato da varie anomalie a carico del cervello e di alcuni organi di senso. Inoltre, mutanti nulli per questo gene presentano fino al quarto mese di vita un certo ritardo di crescita e ipogonadismo a causa di bassi livelli degli ormoni pituitari.
Uno studio effettuato nel nostro laboratorio ha evidenziato che Otx1 svolge un ruolo importante anche nella produzione delle cellule del sangue: è espresso differenzialmente in progenitori ematopoietici, in particolare nella filiera eritroide; la sua inattivazione provoca un difetto eritroide cell-autonomous; svolge la sua azione nell’eritropoiesi attraverso Scl, un master regulator della differenziazione eritroide.
Il mio lavoro di tesi è stato diretto a comprendere se Otx1 possa essere coinvolto anche nel differenziamento del lineage mielo-monocitario dal momento che Otx1 è espresso nei precursori bipotenti di granulociti e macrofagi.
In primo luogo ho analizzato la funzione di questo gene nei precursori della filiera mielo-monocitaria attraverso saggi clonogenici in vitro. Paragonando cellule di midollo osseo di topi wild type e Otx1-/- ho rilevato che sebbene il numero complessivo dei precursori mieloidi risulti normale, nei topi mutanti la frequenza delle singole popolazioni mielo-monocitarie è alterata. In particolare l’inattivazione di Otx1 produce una significativa diminuzione dei progenitori mielo-monocitari (CFU-GM) e monocitari (CFU-M) ed un concomitante incremento dei precursori granulocitari (CFU-G).
In secondo luogo, ho analizzato la possibilità che Otx1 interagisse con Scl anche nel determinare il commitment del lineage mielo-monocitario. Per fare questo ho verificato se l’espressione costitutiva di Scl fosse in grado di ristabilire le normali proporzioni delle sottopopolazioni mieloidi utilizzando una linea di topi knock-out per Otx1 ed overesprimenti Scl. I risultati hanno rivelato che l’espressione del transgene non è sufficiente a recuperare comletamente lo sbilanciamento osservato negli Otx1-/-. Tale osservazione suggerisce quindi che Otx1 contribuisca al controllo della differenziazione mielo-monocitaria attraverso una cascata trascrizionale distinta o solo parzialmente sovrapponibile a quella utilizzata nell’eritropoiesi.
Infine, nell’intento di individuare altri possibili geni target di Otx1, ho intrapreso lo studio dell’espressione di due regolatori della differenziazione di granulociti e macrofagi, quali PU.1 e C/EBPa, per poi andare ad analizzare le eventuali variazioni della loro espressione in cellule di midollo e pools di colonie mielo-monocitarie. I dati ottenuti indicano che la perdita di funzione di Otx1 è associata nel midollo ad una diminuzione dei livelli di espressione di PU.1 pari circa al 60%. Tale risultato è in accordo con precedenti studi che dimostrano che la down-regolazione di PU.1 determina un aumento della granulopoiesi e una concomitante diminuzione della differenziazione in senso macrofagico. L’analisi dell’espressione di C/EBPa ha invece prodotto risultati variabili, suggerendo che l’attività del gene non sia grandemente influenzata dall’azione di Otx1. In conclusione, il gene Otx1, essenziale per la morfogenesi del cervello, è importante anche nell’ematopoiesi, non solo nella produzione delle cellule eritroidi, ma anche nell’ambito del lineage mielo-monocitario, dove verosimilmente esercita un’azione di controllo a livello del commitment dei progenitori bipotenti.