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[ITA] Da quando la teoria endosimbiotica per l’origine della cellula eucariotica è stata accolta, lo studio della simbiosi nella biologia evoluzionistica rappresenta un campo in crescente espansione, incoraggiato dall’innovazione e dal rapido progresso tecnologico. In particolare, la ricerca sui microbiomi associati ad organismi ospite ha promosso lo studio dei simbionti batterici e del loro ruolo nella relazione simbiotica.
Questo lavoro di tesi è stato condotto su un sistema simbiotico ben noto, costituito da ciliati del genere Euplotes come ospiti, nello specifico quelli inclusi nel clade B, caratterizzati dall’associazione costante con un batterio endosimbionte essenziale e obbligato; in aggiunta, possono essere presenti fino a cinque diversi endosimbionti accessori.
Attraverso l’approccio del ciclo completo dell’rRNA, combinato con metodi di sequenziamento ad alto rendimento (high-throughput), due ulteriori simbionti accessori sono stati rilevati nel corso di questo lavoro di tesi, il cui obiettivo principale è stato indagare il ruolo dei simbionti accessori di Euplotes, focalizzando l’attenzione su quelli appartenenti al loro gruppo più rappresentato, la famiglia ‘Candidatus Midichloriaceae’ (Alphaproteobacteria). Attraverso l’uso di strumenti bioinformatici, i loro genomi sono stati esaminati, per confrontare le loro caratteristiche di base, e i rispettivi metabolismi e funzioni. Questi ultimi si confermano essere per lo più depauperati, coerentemente allo stile di vita endosimbiotico dei batteri. Alcuni di questi simbionti hanno anche perso la capacità di produrre autonomamente ATP, e il loro approvvigionamento energetico dipende interamente dal sottrarre ATP in modo diretto dall’ospite. Sono stati trovati geni per la costruzione del flagello e per sistemi di secrezione di tipo IV, probabilmente coinvolti anche nelle interazioni ospite-simbionte. Sono inoltre state inferite le relazioni filogenetiche all’interno della famiglia, e sono stati mappati sui risultanti alberi evolutivi tratti sia ecologici sia genomici, tuttavia nessun pattern evolutivo univoco è emerso.
Un altro obiettivo di questa tesi è stato acquisire una migliore comprensione della biologia di un altro simbionte accessorio di Euplotes, ossia ‘Candidatus Nebulobacter yamunensis’ (Thiotrichales, Gammaproteobacteria). Il suo genoma è stato assemblato, analizzato e confrontato con quello del batterio a vita libera Fastidiosibacter lacustris (Thiotrichales, Gammaproteobacteria) senza mostrare differenze significative, mentre invece soltanto Fastidiosibacter ha mostrato crescita nei tentativi condotti in parallelo. La possibile recente acquisizione di ‘Ca. Nebulobacter yamunensis’ come simbionte di Euplotes, o un ciclo vitale complesso che alterna una fase a vita libera a una simbiotica, potrebbero spiegare i risultati ottenuti. Il simbionte è anche coinvolto in una curiosa associazione con ‘Candidatus Cyrtobacter zanobii’ (‘Ca. Midichloriaceae’, Alphaproteobacteria), condividendo con esso l’ambiente citoplasmatico all’interno dello stesso ospite. L’analisi comparativa dei rispettivi genomi ha rivelato un pattern di complementarietà riguardante i loro trasportatori, il quale potenzialmente consente ai due simbionti di limitare la competizione per le risorse e quindi di coesistere.

[ENG] Since the acceptance of the endosymbiotic theory of eukaryogenesis, the study of symbiosis in evolutionary biology has been an ever-increasing field, fostered by rapid technological progress and innovation. In particular, the research on host-associated microbiomes promoted the study of bacterial symbionts and their role in the symbiotic relationship.
This thesis work was conducted on the symbiotic system involving ciliates of the genus Euplotes as hosts, specifically those included in the clade B, characterized by the consistent association to an essential and obligate bacterial endosymbiont as well as up to five different accessory endosymbionts.
By using the full-cycle rRNA approach, combined with high-throughput sequencing methods, two additional accessory symbionts of Euplotes were also detected during this work, whose main aim was to investigate the role of accessory symbionts of Euplotes focusing on their most represented group, namely the family ‘Candidatus Midichloriaceae’ (Alphaproteobacteria). Using bioinformatic tools, symbiont genomes from different hosts were examined, to compare their basic features, as well as their reconstructed metabolisms and functions. These are confirmed as mostly depleted, consistent to the endosymbiotic lifestyle of the bacteria. Some of these symbionts even lost the autonomous capability to produce ATP and rely entirely on stealing ATP from the host. Genes for the construction of flagella and type IV secretion systems were found, possibly involved also in host-symbiont interactions. Phylogenetic relationships within the family were also inferred, and both genomic and ecological traits were mapped on the obtained phylogenies, but no univocal evolutionary pattern emerged.
Another aim of the thesis was to acquire a more profound understanding on the biology of another accessory symbiont of Euplotes, namely ‘Candidatus Nebulobacter yamunensis’ (Thiotrichales, Gammaproteobacteria). Its genome was assembled, analyzed and compared to that of the free-living Fastidiosibacter lacustris (Thiotrichales, Gammaproteobacteria) showing almost no difference, whereas parallel growth attempts provided bacterial growth only for Fastidiosibacter. The possibly recent acquisition of ‘Ca. Nebulobacter yamunensis’ as symbiont of Euplotes, or a complex lifecycle alternating a free-living phase to a symbiotic phase, could explain the obtained results. The symbiont is also involved in an oddly consistent association with ‘Candidatus Cyrtobacter zanobii’ (‘Ca. Midichloriaceae’, Alphaproteobacteria), sharing the same host cytoplasm. The comparative analysis of their respective genomes revealed a complementary pattern in their transporter collection, potentially allowing the two symbionts to coexist in the same environment by limiting competition for resources.