• Anticorpi

La IgG4 related disease (IgG4-RD) è una sindrome ad eziologia in gran parte sconosciuta costituita da un insieme di disordini che condividono specifiche caratteristiche patologiche, sierologiche e cliniche.
Tali caratteristiche includono la tumefazione “tumor-like” degli organi interessati, un infiltrato linfocitario ricco di plasmacellule IgG4-positive, l’incremento di IgG4 sieriche (con un alterato rapporto IgG4/IgG totali) e un grado variabile di fibrosi tissutale..
Il ruolo delle IgG4 nella patogenesi della malattia è ancora poco chiaro: sono una sottoclasse unica nella struttura e funzione, per la possibilità di “scambio” tra Fab, che crea anticorpi bispecifici ma funzionalmente monovalenti, che non possono attivare la via del complemento e legare in modo stabile i recettori per l’Fc attivatori.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è di analizzare in modo più approfondito il rapporto tra gli anticorpi sierici ed i fibroblasti tissutali nella produzione di citochine e chemochine importanti nella patogenesi della malattia.
Sono stati selezionati 15 pazienti con IgG4-RD nel cui siero sono presenti titoli elevati di IgG4.
Frazioni di IgG totali sono state isolate dal siero di 10 pazienti mediante precipitazione del siero con solfato di ammonio e successive cromatografia di affinità su Proteina A (che permette di purificare IgG1, IgG2 e IgG4 dal resto delle proteine precipitate dall’ammonio solfato).
Colture di fibroblasti di cute sono state ottenute mediante trattamento con tripsina e collagenasi di frammenti di tessuto cutaneo prelevati durante biopsie o altri interventi chirurgici. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati al 3°-5° passaggio delle cellule in coltura.
Le IgG sono state incubate a tempi e concentrazioni differenti su fibroblasti. Si è poi proceduto a valutare il pattern di citochine prodotte nel supernatante di coltura.
In esperimenti preliminari è stato utilizzato un multiarray specifico per citochine umane ed è stato osservato un notevole aumento di produzione di IL-8, GM-CSF, Angiogenina a seguito dell’incubazione dei fibroblasti con le IgG di pazienti. Ulteriori conferme di questo risultato iniziale sono arrivate mediante ELISA a sandwich che ha dimostrato che le IgG di pazienti con IgG4-RD inducono produzione di IL-8 da parte dei fibroblasti.

In parallelo sono stati effettuati esperimenti di Immunofluorescenza per valutare il legame delle IgG ai fibroblasti, sia fissati con etanolo/acetone (che permeabilizza le cellule) che con paraformaldeide (che lascia la membrana intatta). Le IgG di alcuni pazienti legano le cellule anche quando queste non vengono permeabilizzate, segno della presenza dell’antigene riconosciuto sulla membrana esterna del fibroblasto.

Gli esperimenti da noi effettuati suggeriscono quindi che IgG presenti nel siero di pazienti con IgG4-RD legano la membrana dei fibroblasti ed ne inducono la produzione di IL-8.

Al momento sono in corso studi volti a definire meglio quali potrebbero essere gli antigeni extracellulari riconosciuti dalle IgG e quali sono le vie di signalling intracellulare coinvolte.
Inoltre l’analisi separata di IgG1, IgG2 e IgG4 permetterà di definire quale quota di IgG è responsabile dell’attivazione dei fibroblasti