• ADMA
• ADMA
• bovina
• bovine
• frisona
• italian friesian
• mastite
• mastitis
• PCC
• PCC
• PCT
• PCT
• SDMA
• SDMA

RIASSUNTO:
La mastite bovina rappresenta una significativa sfida economica e di benessere animale nell'allevamento delle bovine da latte. La diagnosi comune della mastite si basa sulla conta delle cellule somatiche (SCC) nel latte, un metodo rapido ma poco specifico per le infezioni batteriche
Studio 1: L'obiettivo era valutare l'utilizzo di un kit ELISA per la PCT bovina (Cusabio, Cina) per misurare la PCT in campioni di latte bovino. La convalida è stata eseguita utilizzando 10 campioni di plasma e i corrispondenti campioni di latte provenienti da vacche di razza Frisona italiana affette da mastite. È stato calcolato il limite di rilevamento (LOD). Il coefficiente di variazione (CV%) delle letture di cinque campioni di plasma misurati cinque volte nella stessa piastra (intra-assay) e il CV% degli stessi cinque campioni letti cinque volte in tre piastre separate è stato valutato. Il parallelismo è stato determinato mediante diluizioni seriali a due volte di cinque campioni di plasma e i corrispondenti campioni di latte. I campioni di latte sono stati analizzati con e senza centrifugazione. Per quanto riguarda la PCT nel plasma, il LOD è risultato essere di 40pg/ml, il metodo ha presentato un CV interno ed esterno <23,7%, e il parallelismo ha mostrato valori di recupero molto buoni. Il kit ELISA studiato può misurare le concentrazioni di PCT nel plasma bovino. Gli anticorpi del kit non riescono a legare la PCT nei campioni di latte perché tutti i campioni di latte centrifugati hanno mostrato un LOD inferiore rispetto ai campioni vuoti. Solo tre campioni di latte non centrifugati hanno mostrato concentrazioni misurabili di PCT. A causa di questi risultati, il kit ELISA commerciale investigato non può essere impiegato per la rilevazione di PCT nei campioni di latte.
Studio 2: L’obiettivo di questo progetto è stato quello di valutare la concentrazione di PCT, PCC, ADMA e SDMA in una popolazione di bovine sane di razza Frisona Italiana in diversi tempi di campionamento. I criteri di inclusione sono stati: anamnesi dell’asciutta fisiologica, esame obiettivo generale nella norma ed esame obiettivo particolare della mammella nella norma con CMT <1 (Ruegg e Erskine, 2019) e SCC <150.000 cell/ml per le primipare e <250.000 cell/ml per le pluripare (de Has et al., 2008, Windig et al., 2010). Sono stati esclusi tutti i soggetti che hanno sviluppato mastite o altra patologia nel corso dello studio. I campionamenti sono avvenuti a T0 (15 giorni in mungitura (GIM)), T1 (60 GIM) e T2 (150 GIM). PCT è stata valutata mediante il bovine procalcitonin ELISA kit (Cusabio, Cina), le PCC secondo il metodo di Levine e colleghi (1990) e ADMA e SDMA secondo il metodo di Teerlink (2007). Nel seguente progetto sono state incluse un totale di 17 bovine per l’analisi di PCT, 19 bovine per l’analisi di PCC e 21 bovine per l’analisi di ADMA e SDMA. Le concentrazioni mediane di PCT sono state di 64,29 pg/ml (T0), 75,36 pg/ml (T1) e 77,5 pg/ml (T2), quelle di PCC sono state rispettivamente di 0,17 nmol/ml/mg, 0,14 nmol/ml/mg e 0,20 nmol/ml/mg, per ADMA sono state rispettivamente di 0,11 micomol/L, 0,11 micromol/l, e 0,10 micro mol/L e di 2,21 microgr/dl, 2,08 microgr/dl e 2,08 microgr/dl. Infine le concentrazioni mediane di SDMA a tre tempi sono state rispettivamente di 0,11 micromol/L, 0,12 micromol/L e 0,10 micromol/L e di 2,28 microgr/dl, 2,56 microgr/dl e 2,10 microgr/dl. Per nessun biomarker è stata individuata una differenza statisticamente significativa tra i tre tempi di campionamento.
Studio 3: L’obiettivo di questo studio è stato quello di valutare la concentrazione di PCT, PCC, ADMA e SDMA in bovine frisone sane (SN), affette da mastite clinica (MC) e affette da mastite subclinica (MSC). I criteri di inclusione sono stati per i soggetti sani la presenza di un esame obiettivo generale nella norma ed esame obiettivo particolare della mammella nella norma con CMT <1 (Ruegg e Erskine, 2019) e SCC <150.000 cell/ml per le primipare e <250.000 cell/ml per le pluripare (de Has et al., 2008, Windig et al., 2010). Per i soggetti patologici i criteri di inclusione sono stati un CMT >1 (Ruegg e Erskine, 2019) e SCC >150.000 cell/ml per le primipare e >250.000 cell/ml per le pluripare (de Has et al., 2008, Windig et al., 2010), in assenza di segni clinici evidenti sia a livello di mammella che di latte prodotto, sono stati classificati come soggetti con mastite subclinica (Andrews et al., 2004, Blowey e Edmondson 2010). La concentrazione di PCT è stata valutata mediante il bovine procalcitonin ELISA kit (Cusabio, Cina), le PCC secondo il metodo di Levine e colleghi (1990) e ADMA e SDMA secondo il metodo di Teerlink (2007). Per PCT sono state evidenziate differenze statisticamente significative tra SN (77,81 pg/ml) e patologici (MSC 107,97 pg/ml; MC 144,72 pg/ml) ma non tra MC e MSC. Il cut-off è risultato essere >00,83 pg/ml con sensibilità (Se) e specificità (Sp), rispettivamente di 71,08% e 56,67%. Sono state evidenziate differenze nella concentrazione di PCC dei SN (0,13nmol/ml/mg) e i patologici (MSC 0,04 nmol/ml/mg; MC 0,03 nmol/ml/mg) ma non tra MSC e MC. Il valore di cut off è risultato essere >0,07 nmol/ml/mg con una Se di 73,47% e una Sp di 65,56%. Anche per ADMA sono state evidenziate differenze statisticamente significative tra SN (0,11 micromol/L; 2,22 microgr/dl) e patologici (MSC 0,26 micromol/L, 5,14 microgr/dl; MC 0,26 micromol/L, 5,22 microgr/dl) ma non sono state evidenziate differenze tra MSC e MC. I valori di cut off sono risultati essere >0,164 micromol/L con Se e Sp rispettivamente di 80,41% e 77,78% e >3,275 microgr/dl con una Se del 88,64% e una Sp dell’82,95%. Non state messe in evidenza differenze tra concentrazioni di SDMA nei SN (0,11 micromol/L; 2.25 microgr/dl), MSC (0,10 micromol/L; 2,09 microgr/dl) e MC (0,08 micromol/L; 1,68 microgr/dl).
In conclusione i biomarker analizzati non presentano alterazioni nei soggetti sani nel corso della lattazione. PCT e ADMA presentano un potenziale ruolo diagnostico per il riconoscimento di soggetti affetti da mastite mentre per PCC sono necessari ulteriori studi.

ABSTRACT:Bovine mastitis poses a significant economic and animal welfare challenge in dairy cattle industry. Also considering that mastitis is the first reason of antimicrobial use in dairy cows. Commonly, diagnosis of mastitis relies on the somatic cell count in milk, a quick and cheap test but with low sensitivity and specificity for bacterial infections.
Study 1: The aim was to evaluate the use of an ELISA kit for bovine procalcitonin (PCT) (Cusabio, China) to measure PCT in bovine milk samples. Validation was conducted using 10 plasma samples and corresponding milk samples from Italian Friesian cows with mastitis. The limit of detection (LOD) was calculated. The coefficient of variation (CV%) of the readings for five plasma samples measured five times on the same plate (intra-assay) and the CV% of the same five samples read five times on three separate plates were assessed. Parallelism was determined through serial twofold dilutions of five plasma and corresponding milk samples. Milk samples were analyzed with and without centrifugation. Regarding plasma PCT, the LOD was found to be 40 pg/ml. The method exhibited internal and external CVs <23.7%, and parallelism showed very good recovery values. The studied ELISA kit can measure bovine plasma PCT concentrations. However, the kit's antibodies failed to bind PCT in milk samples, as all centrifuged milk samples showed a lower LOD than blank samples. Only three non-centrifuged milk samples showed measurable PCT concentrations. Due to these results, the investigated commercial ELISA kit could not be employed for the detection of PCT in milk samples.
Study 2: The aim of this project was to evaluate the concentration of PCT, PCC, ADMA, and SDMA in a population of healthy Italian Friesian cows at different sampling times. Inclusion criteria included a history of physiological dry periods, a normal general examination, a specific udder examination with CMT <1 (Ruegg and Erskine, 2019), and somatic cell count (SCC) <150,000 cells/ml for primiparous and <250,000 cells/ml for multiparous cows (de Has et al., 2008, Windig et al., 2010). Subjects that developed mastitis or other pathologies during the study were excluded. Sampling occurred at T0 (15 days in milking (DIM)), T1 (60 DIM), and T2 (150 DIM). PCT was assessed using the bovine procalcitonin ELISA kit (Cusabio, China), PCC according to the method of Levine et al. (1990), and ADMA and SDMA according to the method of Teerlink (2007). The project included a total of 17 cows for PCT analysis, 19 cows for PCC analysis, and 21 cows for ADMA and SDMA analysis. Median concentrations of PCT were 64.29 pg/ml (T0), 75.36 pg/ml (T1), and 77.5 pg/ml (T2). PCC concentrations were 0.17 nmol/ml/mg, 0.14 nmol/ml/mg, and 0.20 nmol/ml/mg, respectively. ADMA concentrations were 0.11 micromol/L, 0.11 micromol/L, and 0.10 micromol/L, while SDMA concentrations were 2.21 microgr/dl, 2.08 microgr/dl, and 2.08 microgr/dl. Finally, median SDMA concentrations at three times were 0.11 micromol/L, 0.12 micromol/L, and 0.10 micromol/L, and 2.28 microgr/dl, 2.56 microgr/dl, and 2.10 microgr/dl, respectively. No statistically significant differences were found for any biomarker among the three sampling times.
Study 3: The objective of this study was to evaluate the concentration of PCT, PCC, ADMA and SDMA in healthy Friesian cows (H), affected by clinical mastitis (CM) and affected by subclinical mastitis (SCM). The inclusion criteria for healthy subjects were the presence of a normal general physical examination and normal physical examination of the breast with CMT <1 (Ruegg and Erskine, 2019) SCC <150,000 cells/ ml for primiparous women and <250,000 cells/ml for multiparous women (de Has et al., 2008, Windig et al., 2010). For pathological subjects, the inclusion criteria were a CMT >1 (Ruegg and Erskine, 2019) and SCC >150,000 cells/ml for primiparas and >250,000 cells/ml for multiparas (de Has et al., 2008, Windig et al., 2010), in the absence of evident clinical signs both at the level of the udder and the milk produced, they were classified as subjects with subclinical mastitis (Andrews et al., 2004, Blowey and Edmondson 2010). PCT concentration was assessed using the bovine procalcitonin ELISA kit (Cusabio, China), PCC according to the method of Levine and colleagues (1990), and ADMA and SDMA according to the method of Teerlink (2007). For PCT, statistically significant differences were highlighted between H (77.81 pg/ml) and pathological (SCM 107.97 pg/ml; CM 144.72 pg/ml) but not between MC and MSC. The cut-off was found to be >00.83 pg/ml with sensitivity (Se) and specificity (Sp), respectively, of 71.08% and 56.67%. Differences in the PCC concentration of H (0.13nmol/ml/mg) and pathological (SCM 0.04 nmol/ml/mg; CM 0.03 nmol/ml/mg) were highlighted but not between MSC and MC. The cut off value was found to be >0.07 nmol/ml/mg with a Se of 73.47% and an Sp of 65.56%. Also for ADMA, statistically significant differences were highlighted between H (0.11 micromol/L; 2.22 microg/dl) and pathological (SCM 0.26 micromol/L, 5.14 microg/dl; CM 0.26 micromol/ L, 5.22 microg/dl) but no differences were highlighted between SCM and CM. The cut off values were found to be >0.164 micromol/L with Se and Sp of 80.41% and 77.78% respectively and >3.275 microg/dl with a Se of 88.64% and a Sp of 82.95 %. No differences were highlighted between SDMA concentrations in the H (0.11 micromol/L; 2.25 microg/dl), SCM (0.10 micromol/L; 2.09 microg/dl) and CM (0.08 micromol/ L; 1.68 microg/dl).
In conclusion, biomarkers showed no alterations in healthy subjects during lactation. PCT and ADMA could serve diagnostically for mastitis, requiring additional studies for PCC.