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Thesis etd-04292020-115634


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
GHIANDONI, CHIARA
URN
etd-04292020-115634
Thesis title
Sintesi di nuovi derivati a struttura monoarilica quali stabilizzatori della Transtiretina. Ricerca di nuove strategie terapeutiche per la FAC (amiloidosi cardiaca familiare)
Department
FARMACIA
Course of study
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Orlandini, Elisabetta
relatore Dott.ssa Ciccone, Lidia
Keywords
  • amiloidosi
  • transtirerina
  • fibrille amiloidi
Graduation session start date
12/06/2020
Availability
Withheld
Release date
12/06/2090
Summary
Le amiloidosi rappresentano un grande gruppo di malattie rare, acquisite o ereditarie, accomunate dalla deposizione anomala di fibrille amiloidi. In molti casi il loro accumulo può essere localizzato e non provocare alcuna manifestazione sintomatica mentre in altri può estendersi fino ad interessare organi e tessuti, sfociando in patologie multisistemiche.
Strutturalmente questi depositi sono costituiti da materiale di origine glicoproteica derivante da meccanismi di disgregazione e mal ripiegamento (misfolding) delle proteine cellulari. A seconda del precursore amiloidotico si distinguono vari tipi di amiloidosi, spesso caratterizzate da quadri clinici anche molto differenti.
Attualmente le forme di amiloidosi sistemica più diffuse sono: AA (amiloidosi reattiva ad infiammazione cronica); AL (amiloidosi da catene leggere); ATTR (amiloidosi ereditarie); ATTRWT (amiloidosi senile).
La transtiretina (TTR) è una proteina omotetramerica dal peso molecolare di 55 kDa, la cui funzione principale è rappresentata dal trasporto dell’ormone tiroideo T4 e del retinolo nel plasma e nel fluido cerebrospinale. Essendo coinvolta nella patogenesi del terzo tipo più comune di amiloidosi (dopo AL ed AA), negli anni è stata ampiamente studiata. Dalla struttura cristallografica del suo complesso con l’ormone T4 è possibile individuare due tasche di legame simmetriche a forma di imbuto. In esse possono essere distinte due porzioni: una più esterna, denominata outer binding pocket ed una più interna, denominata inner binding pocket, a livello delle quali sono presenti sei aree indispensabili per l’accomodamento degli atomi di alogeno del ligando naturale: HBPs1, HBPs2 e HBPs3.
I modi con i quali la T4 e numerose small molecules legano la TTR si distinguono in forward binding mode e reverse binding mode. Nel forward binding mode la disposizione del ligando con i suoi sostituenti anionici, per esempio i carbossilati, è orientata verso l’outer binding pocket. In questo modo si formano interazioni elettrostatiche favorevoli con il gruppo amminico della Lys15/15' (modalità di legame caratteristica dell’ormone T4, Fig.1). Nell’orientamento reverse binding mode, invece, i gruppi carbossilati sono disposti verso l'inner binding pocket e formano legami a idrogeno con Ser117/117' e Thr119/119'. Questa interazione non è inusuale, in quanto è stata osservata per alcuni inibitori della formazione delle fibrille amiloidi come ad esempio il diclofenac.
Le amiloidosi da transtiretina si distinguono a seconda che siano generate dal misfolding della proteina nativa, wild-type (ATTRWT), o di una forma mutata dovuta a mutazioni genetiche puntiformi (amiloidosi eredo-familiari). Quest’ultime, in base al fenotipo caratterizzante, si suddividono in FAC (cardiomiopatia amiloide familiare), FAP (polineuropatia amiloide familiare) e CNSA (amiloidosi selettiva del sistema nervoso centrale).
Nelle amiloidosi da transtiretina le strategie terapeutiche più promettenti sviluppate nel corso degli anni sono rappresentate dall’utilizzo di:
• Inibitori della sintesi di transtiretina strutturalmente alterata: trapianto ortotopico di fegato e silenziatori genici (ASO e siRNA);
• Stabilizzatori della struttura tetramerica della transtiretina, la cui dissociazione rappresenta lo step iniziale del processo di fibrillogenesi: composti naturali tra cui resveratrolo, curcumina, genisteina, epigallocatechina gallato e composti di sintesi quali diflunisal e tafamidis (Fig. 2);
• Disgreganti delle fibrille amiloidi preformate: l’antibiotico doxiciclina e l’acido biliare tauroursodesossicolico, anticorpi anti-SAP.
La stabilizzazione del tetramero è la strategia scelta dal gruppo di ricerca presso il quale è stato svolto il presente lavoro di tesi, che da tempo si occupa dello studio di questo approccio terapeutico.
Nell’attività di laboratorio condotta presso il Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, è stata affrontata la sintesi di nuovi derivati a struttura monoarilica di tipo B (Fig.4) quali potenziali stabilizzatori della transtiretina. Tali molecole sono state progettate sulla base dei risultati, ottenuti dal gruppo di ricerca, su una serie di composti a struttura monoarilica di tipo A, sintetizzati in quanto analoghi di noti FANS capaci di stabilizzare la TTR. Tra quest’ultimi il principale lead considerato è stato il diflunisal (Fig.2).
Nei composti di tipo A (acidi benzilidenaminossipropanoici) il gruppo carbossilico, necessario per l’interazione con la Lys 15 (forward binding mode) o con la Ser 117 (reverse binding mode), è legato ad una porzione aromatica, variamente sostituita, tramite un linker flessibile costituito da una catena aminossietilica (CH=N-O-CH2-CH2). Tale porzione sostituisce il linker aromatico che nei FANS lega i due gruppi farmacoforici (anello aromatico sostituito e gruppo carbossilico) necessari per il binding con il sito attivo della TTR. Anche in questa famiglia di molecole così come in altre classi di farmaci, quali gli antinfiammatori, i farmaci adrenergici e gli antibiotici beta-lattamici, la sostituzione di una porzione aromatica con una catena eteroatomica (CH=N-O-CH2-) ha condotto a composti dotati dell’attività desiderata, confermando che tale porzione può essere considerata bioisostera dell’anello aromatico (Fig.3). In aggiunta a ciò, i sostituenti presenti sul carbonio imminico, che nei composti di tipo A hanno portato all’ottenimento di molecole attive, sono stati il gruppo fenilico metossi sostituito ed il gruppo fluorenilico.
L'analisi a raggi X del complesso ligando di tipo A-TTR ha mostrato che l'interazione all'interno del sito attivo, per questi composti, ha dei margini spaziali che rendono possibile apportare modifiche alla lunghezza del linker etero-atomico. Sulla base di ciò è stato quindi ipotizzato che l’allungamento della catena aminossimetilica potesse portare a molecole nelle quali l'attività inibitrice sulla formazione di fibrille fosse mantenuta o aumentata.
Nel presente lavoro di tesi sono stati dunque sintetizzati una serie di composti di tipo B nei quali la catena eteroatomica, già presente nei composti di tipo A, è stata allungata di un atomo di carbonio (CH=N-O-CH2-CH2-CH2). Sull’anello aromatico inoltre sono stati inseriti sostituenti che nei composti monoarilici di tipo A hanno mostrato la migliore attività, ad esempio il gruppo metossilico. Come altro sostituente è stato poi considerato il gruppo ossidrilico in quanto presente nel resveratrolo, un composto naturale capace di interagire con il sito attivo della TTR. Infine, con lo scopo di migliorare l’interazione con il sito attivo, è stato introdotto sull’anello aromatico un gruppo carbossilico nelle tre posizioni o, m, p.
È stata pertanto affrontata la sintesi dei composti di tipo B a-h
Per l’ottenimento dei prodotti di tipo B sono stati sintetizzati degli intermedi chiave di sintesi, ovvero le ossime 1a-h.
Date le basse rese della via sintetica che prevede le ossime come prodotto di partenza e data la formazione di sottoprodotti, è stata poi intrapresa una nuova via sintetica. Tale via è stata finalizzata all’ottenimento del composto 4, come intermedio chiave di sintesi, da far reagire con le benzaldeidi opportunamente sostituite (Fig.6) per produrre i composti desiderati in buone rese e senza la presenza di sottoprodotti di difficile purificazione. In seguito all’emergenza Covid-19 la nuova via sintetica è stata interrotta all’ottenimento del composto 4.
La seconda parte del lavoro di tesi è stata incentrata sul campo terapeutico, attualmente in fase di rapida evoluzione, della FAC (amiloidosi cardiaca familiare). Nell’ambito delle ATTR, infatti, uno degli organi generalmente più colpiti dalla deposizione di fibrille amiloidi è rappresentato dal cuore. Anche l’amiloidosi cardiaca da transtiretina è suddivisa in due tipologie: quella correlata al misfolding della proteina nativa (ATTR-CAWT) e quella derivante dalla forma mutata (ATTR-CAV o FAC). Se per la prima la ricerca di una cura appropriata risulta tuttora ostacolata da vari fattori, come l’età di esordio generalmente tardiva e la presenza di comorbidità nei pazienti, per la seconda sono stati recentemente ottenuti risultati incoraggianti. Le strategie terapeutiche per la FAC ripercorrono le stesse modalità d’intervento sopra citate e utilizzate anche per altri fenotipi di ATTR. In tal caso però gli studi clinici hanno coinvolto pazienti con interessamento cardiaco, il cui quadro clinico è stato, nella maggior parte dei casi, caratterizzato da cardiomiopatia restrittiva e conseguente compromissione della funzionalità del cuore. Una delle sperimentazioni più importanti è stata quella relativa al tafamidis, nella quale i risultati dello studio di fase III (ATTR-ACT) hanno permesso l’approvazione del farmaco, attualmente primo ed unico trattamento nell’Unione Europea.
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