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Tesi etd-04232012-072335


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
LANDE, CATERINA
URN
etd-04232012-072335
Title
VEICOLAZIONE DI FARMACI OLIGONUCLEOTIDICI IN CELLULE MUSCOLARI LISCE VASCOLARI: BASI PER UNA TERAPIA GENICA DELL’ATEROSCLEROSI
Settore scientifico disciplinare
BIO/13
Corso di studi
MORFOLOGIA E FUNZIONE NORMALE E PATOLOGICA DI CELLULE E TESSUTI
Commissione
tutor Cecchettini, Antonella
relatore Citti, Lorenzo
relatore Trivella, Maria Giovanna
Parole chiave
  • farmaci oligonucleotidici
  • terapia genica
  • cellule muscolari lisce
  • aterosclerosi
Data inizio appello
18/05/2012;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le cellule muscolari lisce vascolari (Vascular Smooth Muscle Cells, VSMC), a causa della loro plasticità e della loro abilità nel passare da un fenotipo fisiologico a uno patologico-attivato, giocano un ruolo centrale nell’insorgenza e nella progressione dell’aterosclerosi e delle malattie cardiovascolari. <br>Sono stati individuati diversi fattori responsabili della modulazione fenotipica.<br>Fra le molte citochine e fattori di crescita, il “Platelet Derived Growth Factor – BB”, PDGF-BB, è stato indicato come un fattore cruciale. Inoltre, anche il fattore di trascrizione Elk-1 ha mostrato una notevole importanza.<br>Si è cercato, attraverso due diversi approcci, di indagare sugli effetti molecolari sulla modulazione fenotipica, indotti da questi fattori.<br>Per il primo approccio è stato utilizzato un ribozima di tipo “hammerhead” diretto contro il recettore di membrana PDGFR-β, con lo scopo di inibire la via del segnale del PDGF in colture primarie di VSMC di maiale. I ribozimi, complessati ad un veicolo cationico a base polimerica, sono stati somministrati alle VSMC nel terreno di coltura consentendo il loro rilascio all’interno delle cellule. L’effetto osservato è stato un indebolimento significativo del meccanismo di attivazione innescato dal PDGF-BB. Infatti, a seguito del trattamento è stato registrato un decremento sia della migrazione che della proliferazione cellulare. <br>Per convalidare gli effetti funzionali del silenziamento del PDGFR-β, l’attenzione è stata rivolta allo stato di fosforilazione di due proteine, la PDI-A3 e l’HSP-60, perché in precedenza erano state identificate come elementi caratteristici dell’attivazione fenotipica a seguito di stimolazione con PDGF-BB. È interessante sottolineare che la fosforilazione della PDI-A3 è contrastata dalla somministrazione del ribozima, suggerendo che la PDI-A3 è un fattore a valle della cascata del segnale recettoriale, mentre la fosforilazione dell’HSP-60 è aumentata a seguito del trattamento con il ribozima. Queste osservazioni contrastanti suggeriscono che il PDGF-BB potrebbe innescare vie del segnale parallele che potrebbero essere modulate dalle isoforme alternative del recettore per il fattore di trascrizione.<br>Il secondo approccio ha previsto l’impiego di un decoy a DNA, che competa per il legame con il fattore di trascrizione per Elk-1. Questa molecola è stata somministrata alle VSMC in coltura utilizzando eritrociti magnetici ingegnerizzati singenici. Il protocollo di ingegnerizzazione è stato ottimizzato, e l’effettiva internalizzazione del decoy è stata testata tramite analisi in HPLC e in microscopia confocale. L’effetto del decoy è stato verificato attraverso saggi di migrazione e proliferazione. I risultati hanno portato alla convalida dell’Elk-1 come fattore chiave nella modulazione fenotipica.<br>In definitiva, le strategie di silenziamento qua descritte ci permettono di studiare meccanismi di regolazione dell’attivazione delle VSMC con lo scopo di fornire nuovi punti di vista in queste complesse reti di segnale, attraverso approcci vari ed innovativi.<br> Questo approccio, inoltre, apre nuove e attraenti prospettive negli studi funzionali dove la combinazione fra tecniche di silenziamento e analisi proteomica potrebbe permettere l’identificazione di fattori chiave e di nuove reti di meccanismi di patogenesi implicati nelle malattie che coinvolgono le VSMC. <br>
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