• cristallino
• glucosio
• infiammazione

Uno dei requisiti fondamentali per la visione corretta è la trasparenza del cristallino, garan-tita dall’organizzazione spaziale di una sua componente, le fibre, differenziatesi da cellule epiteliali presenti in uno strato nella porzione anteriore della lente. In particolare, in stadi tardivi del differenziamento, le cellule epiteliali vanno incontro ad un programma degrada-tivo di tutti gli organelli intracellulari cellulari chiamato “autodistruzione totale”, che porta alla formazione della organelle-free zone (OFZ), un mosaico citoplasmatico otticamente omogeneo, che garantisce la trasmissione della luce sulla retina. L’innescarsi di questo pro-cesso è imputabile a variazioni di concentrazione di molecole solubili, tra cui le specie reat-tive dell’ossigeno (ROS), con conseguente danno mitocondriale ed attivazione della cascata apoptotica. L’OFZ risulta essere particolarmente sensibile a varie fonti di stress – tra cui ra-diazioni UV, radicali liberi e condizioni di iperglicemia – che possono portare ad incremen-to dei ROS, fenomeni di aggregazione proteica e quindi a compromissione della trasparenza. Al fine di ridurre questo fenomeno, nelle cellule del cristallino vengono abbondantemente espresse le cristalline, una famiglia di heat shock proteins con funzione di chaperones mole-colari, essenziali per il corretto svolgimento del ciclo vitale delle cellule del cristallino, dal-le prime fasi di crescita ed elongazione, fino al differenziamento terminale in fibre lentico-lari.
Tuttavia, la corretta funzionalità delle cristalline è ostacolata da varie condizioni, come alte-razioni genetiche, invecchiamento, patologie e stress glucidico, che possono portare a opa-cizzazione del cristallino. In particolare, la cataratta risulta essere una delle complicanze più debilitanti nei soggetti diabetici, in cui la condizione iperglicemica funge da principale fat-tore scatenante. Il glucosio esplicherebbe la sua attività nociva tramite stimolazione del si-gnaling proinfiammatorio mediato da NF-κB. Il metabolismo del glucosio nella via dei po-lioli prevede prima la sua riduzione, in una reazione NADPH dipendente a sorbitolo, il quale a sua volta è ossidato a fruttosio dalla sorbitolo deidrogenasi (SDH) in una reazione NAD+ dipendente. In questo modo, condizioni iperglicemiche potrebbero indurre la diminuizione dei livelli di intracellulari di NAD+, portando ad una ridotta attività di sirtuine NAD+ dipen-denti coinvolte nella deacetilazione e conseguente inattivazione di NF-κB. Inoltre, condizio-ni iperglicemiche determinano un aumento dei livelli intracellulari di ROS, con la conse-guente attivazione della perossidazione lipidica che genera aldeidi altamente reattive, tra cui il 4-idrossi-2-nonenale (HNE), una molecola in grado di formare addotti con glutatione (GSH), proteine e acidi nucleici. In particolare, l’addotto dell’aldeide con il GSH forma GS-idrossinonanale (GSHNE), substrato dell’aldoso reduttasi, che ne catalizza la riduzione in GS-diidrossinonano (GSDHN), una molecola importante per l’azione proinfiammatoria me-diata da NF-κB.
Queste considerazioni indicherebbero quindi un ruolo rilevante dell’aldoso reduttasi nell’azione proinfiammatoria indotta da D-glucosio e per questa ragione il lavoro di tesi ha previsto inizialmente la valutazione di questo effetto su una linea cellulare epiteliale umana di cristallino (HLECs). In particolare, è stata utilizzata una linea stabilmente transfettata con un plasmide contenente come gene reporter la luciferasi sotto il controllo regolatorio di NF-κB. L’azione proinfiammatoria è stata quindi valutata sia in termini di attivazione di NF-κB che come incremento dell’espressione di cicloossigenasi-2 (COX-2). In queste condizioni è stata anche valutata l’eventuale azione antinfiammatoria del Sorbinil, un noto inibitore dell’aldoso reduttasi. Una parte del lavoro di tesi ha infine previsto la purificazione e la ca-ratterizzazione della sorbitolo deidrogenasi umana ricombinante espressa in una linea cellu-lare di E.coli, le BL21. L’enzima purificato potrà essere utilizzato per la messa a punto di un saggio enzimatico che permetta di valutare il contenuto intracellulare di sorbitolo nelle HLEC sottoposte a condizioni iperglicemiche.