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Tesi etd-04202009-171634


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
MEI, ALESSANDRA
URN
etd-04202009-171634
Title
INTERFERON DI TIPO III (IFNλ2) E RETROVIRUS UMANI ESOGENI ED ENDOGENI
Settore scientifico disciplinare
MED/07
Corso di studi
VIROLOGIA FONDAMENTALE E CLINICA
Commissione
Relatore Prof.ssa Dolei, Antonina
Parole chiave
  • interferenza virale
  • IL28R
  • sonde discriminanti
Data inizio appello
28/04/2009;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
28/04/2049
Riassunto analitico
RIASSUNTO<br>La famiglia di IFN di Tipo III è costituita da tre sottotipi, denominati IFN1, IFN2 e IFN3 (IL-29, IL-28A e IL-28B), che presentano le principali caratteristiche degli IFN noti: esercitano attività antivirale nei confronti di virus citocidi, inducono la produzione di proteine effettrici, come MxA, 2’-5’-oligoA-sintetasi e STAT (Trasduttori del Segnale e Attivatori della Trascrizione), e possiedono attività antiproliferativa e di regolazione cellulare, anche se non agiscono su pressoché tutti i tipi cellulari, come fanno invece gli IFN di Tipo I e II, perché il loro recettore non è universalmente espresso.<br>Lo studio sull’IFN2 si è proposto di valutare: <br>A) gli effetti su un retrovirus esogeno, nel sistema costituito da HIV-1P1 e cellule emopoietiche (cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, e cellule linfoblastoidi T C8166);<br>B) gli effetti su retrovirus endogeni, nel sistema costituito dalla linea astrocitaria U-87MG che esprime due elementi della famiglia HERV-W: MSRV (che produce virioni extracellulari) ed ERVWE1, (che esprime solo il gene env, detto Sincitina-1, a livello di membrana). Entrambi gli elementi si sono precedentemente mostrati suscettibili all’azione di diverse citochine.<br>Le PBMC e C8166 sono state trattate con dosi scalari di IFN di Tipo III, IFN2 per 24h e con una dose di IFN di Tipo I come controllo del sistema. Innanzitutto le colture sono state saggiate per l’instaurarsi dello stato antivirale classico, indotto dall’IFN contro un virus citocida, il virus della stomatite vescicolare bovina (VSV). I valori ottenuti dalla titolazione dei sovranatanti indicano che entrambi gli IFN inibiscono la replicazione del VSV nelle PBMC, mentre le C8166 risultano resistenti. In termini di efficacia, l’IFN di Tipo III è risultato più di 3 Log10 meno efficace rispetto all’IFN di Tipo I. Poiché la replicazione di HIV è influenzata dalle condizioni di crescita della cellula ospite, si è valutato l’eventuale effetto antiproliferativo nei due sistemi cellulari (PBMC e C8166), che potrebbe interferire con lo studio di HIV; pertanto, dopo pre-trattamento con l’IFN, sono state valutate nel tempo la crescita e la vitalità cellulare. Si è evidenziata un’attività antiproliferativa nei confronti delle PBMC, mentre nelle C8166 non è stato osservato alcun effetto anticrescita. Le colture pretrattate con IFNλ2, sono state infettate con il ceppo T-tropico HIV-1P1 e dopo la fase di adsorbimento e nel corso della replicazione virale sono stati valutati i parametri virologici mediante titolazione biologica (Saggio delle Unità Formanti Sincizi, SFU) e determinazione della proteina capsidica p24 in ELISA.<br>I dati hanno mostrato un aumento di legame del virus nelle cellule esposte ad IFN rispetto a quelle non trattate, seguito da un’aumentata replicazione virale. In parallelo è stata valutata l’espressione del principale recettore di HIV, il CD4, e dei corecettori CXCR4 e CCR5, rilevando un incremento dell’espressione di queste macromolecole coinvolte nell’ingresso del virus nelle condizioni esposte all’IFN, sia a livello di mRNA (mediante RT-PCR quantitativa) che a livello di proteina esposta sulla membrana citoplasmatica (tramite citofluorimetria a flusso). Nelle nostre condizioni sperimentali, in PBMC e C8166, l’IFNλ2 si comporta come i più noti IFN di Tipo I per quanto riguarda gli effetti antivirali classici (VSV) e antiproliferativi, come per l’effetto su HIV, aumentandone l’adsorbimento e la replicazione. Poiché è stato trovato maggiore accumulo di CD4, CXCR4 e CCR5 (sia trascritti che proteina di membrana) in cellule trattate con entrambi i Tipi III e I di IFN, è possibile ipotizzare che vi sia una relazione causale con il maggior adsorbimento di HIV, sebbene non si possano escludere altri meccanismi.<br>Le U-87MG sono state esposte a dosi scalari di IFNλ2 (1-100 ng/ml) ed una dose unica di IFN di tipo I (IFNα 5000 IU/ml). L’espressione di MSRVenv e di Sincitina-1 è stata rilevata con RT-PCR quantitativa mediante primers e sonde specifiche in grado di discriminare questi due geni env della famiglia HERV-W, che hanno più del 94% di identità di sequenza, a livello di RNA.<br>I risultati evidenziano una iper-regolazione, dose-dipendente, di MSRV e Sincitina-1 nelle cellule trattate con IFNλ2 e con IFN di Tipo I. Le cellule, pre-trattate o meno con IFN, sono state infettate con HIV, ceppo HIV-1P1. I risultati mostrano una modulazione differenziale dei due retroelementi appartenenti alla stessa famiglia HERV-W, da parte di HIV:<br>- MSRVenv viene iperespresso,<br>- la Sincitina-1 viene inibita,<br>- tali effetti si osservano anche nelle cellule pre-trattate con IFNλ2 e poi infettate con HIV.<br><br>Per chiarire almeno in parte il meccanismo dell’effetto di HIV, gli astrociti U-87MG sono stati trasfettati in modo transeunte con un costrutto plasmidico, contenente il promotore della Sincitina -1 ed il gene reporter della luciferasi, e sono state esposte a concentrazioni scalari della proteina ricombinante Tat. I dati indicano che Tat esogena determina una riduzione dell’attività luciferasica (e quindi dell’attività del promotore) inversamente proporzionale alla concentrazione della proteina Tat utilizzata. Tale riduzione è in accordo con l’iporegolazione dell’espressione della Sincitina-1 ottenuta nell’infezione naturale in vitro con HIV.<br>L’effetto opposto di HIV su MSRVenv e Sincitina-1 conferma che si tratta di 2 retroelementi distinti. Dato che nel promotore dei due retroelementi, la parte virale (LTR) è eguale in MSRV e ERVWE1, è verosimile che la differenza risieda nella parte cellulare del promotore, a monte delle LTR nel DNA cellulare, ovviamente diverso, se i due elementi sono integrati in siti differenti del genoma umano.<br>
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